Non-Target-Analytik deckt neue Spurenstoffe auf

Einleitung

Der Wunsch eines Umweltanalytikers ist es, soviel wie möglich an stofflicher Information über eine Probe, beispielsweise Kläranlagenablauf, Flusswasser, Grundwasser oder Trinkwasser, zu erhalten. Im letzten Jahrzehnt hat das Verhalten organischer Spurenstoffe aus unterschiedlichen Anwendungsbereichen wie Arzneimittel, Haushaltschemikalien, Industrie-chemikalien und Pflanzenschutzmittel in der aquatischen Umwelt ein stark zunehmendes wissenschaftliches Interesse gefunden. Hierzu gehören besonders die Bildung von Umwand-lungsprodukten (Transformationsprodukten, TP) und deren Verhalten sowohl im Ökosystem als auch beispielsweise bei der Trinkwasseraufbereitung aus Oberflächen- oder Grundwas-ser. Ein wichtiges Analysenprinzip zur Untersuchung auf bekannte organische Spurenstoffe (Target) ist die Flüssigkeitschromatographie (HPLC) gekoppelt mit der Massenspektrometrie. Deren enorme Nachweisstärke bis in den ng/L-Bereich, ohne aufwändige Probenvorberei-tung, ermöglichte die Gewinnung einer Vielzahl neuer Erkenntnisse über das Verhalten der Spurenstoffe in der Umwelt. Durch den Einsatz der hochauflösenden Massenspektrometrie (HRMS) in Verbindung mit der HPLC hat der Analytiker nun die Möglichkeit auch Substanzen zu erkennen, die nicht in seiner Target-Liste auftreten. Dieses Vorgehen wird Non-Target-Analytik genannt. Besonders bei der Suche nach Transformationsprodukten in der Umwelt liefert die Non-Target-Analytik wichtige Beiträge.


Flüssigkeitschromatographie mit hochauflösender Massenspektrometrie
(HPLC-HRMS)

Das Auflösungsvermögen ist die Fähigkeit eines Massenanalysators zwei dicht aufeinander-folgende Massen unterscheiden zu können. Das Auflösungsvermögen R ist definiert als das Verhältnis der Massenzahl m eines Ions und der Differenz zu einem zweiten Ion der Masse m + Δm, welche gerade noch unterschieden werden können. Ein Auflösungsvermögen von R = m/Δm = 30.000 ermöglicht die Unterscheidung der Massen von 300 und 300,01. Das Auflösungsvermögen ist nicht zu verwechseln mit der Massengenauigkeit. Diese wird in ppm (parts per million) angegeben. Eine Massengenauigkeit von 5 ppm bedeutet bei einer Masse von 300 m/z, dass die exakte Masse 300,0000 ± 0,0015 m/z beträgt.
Bei Verwendung der hochauflösenden Massenspektrometrie zur Detektion der von der chromatographischen Säule eluierenden Verbindungen erhält man zu jedem Zeitpunkt ein vollständiges Spektrum mit den exakten Massen der Ionen. Die derzeit hauptsächlich einge-setzten hochauflösenden Massenanalysatoren sind die Orbitrap und das Time-of-Flight-Massenspektrometer (TOF). In Bild 1 sind diese beiden Analysatoren gegenübergestellt.

Mehrere Ionen unterschiedlicher Masse generieren in der Orbitrap ein komplexes Signal, dessen Frequenzen mittels Fourier-Transformation (FT) ermittelt werden. Diese sind dem Masse-zu-Ladungsverhältnis (m/z) umgekehrt proportional. (R = 25.000 - 100.000)

Quelle: Thermo Fischer Scientific

 

 

 

 

 


Die Flugzeit der Ionen ist dem Masse-zu-Ladungsverhältnis (m/z) proportional. (R = 30.000 - 50.000)

Quelle: AB Sciex

 

 

 

 

 

Bild 1: Hochauflösende Massenspektrometrie – Gegenüberstellung von Orbitrap und Time-of-Flight-Massenspektrometer (TOF)

Nur durch die hohe Massenauflösung und die Bestimmung der exakten Masse ist es möglich, für die Masse eine Summenformel anzugeben und über das Isotopenmuster abzusichern. Aufgrund der Messunsicherheiten ist diese Summenformel, besonders bei hohen Massen, nicht eindeutig.
Bild 2 zeigt ein LC-HRMS-Chromatogramm (TOF) einer Wasserprobe. Hierbei wurden 100 µL der Probe direkt auf eine Trennsäule gegeben. Zu erkennen ist ein hoher Untergrund mit sehr wenigen Peaks. Die großen Peaks sind Verunreinigungen aus den Eluenten und der Gasversorgung für die Ionenquelle. In Bild 2 (Mitte links) ist ein Ausschnitt des dazugehörigen Contour-Plots dargestellt. Ein sogenannter Peakfinding-Algorithmus extrahiert die Features (exakte Masse und Retentionszeit) aus den Rohdaten. Diese sind in Bild 2 (Mitte rechts) als sogenanntes Masse-Retentionszeit-Diagramm („Punktwolke“) dargestellt. Bei dieser Probe handelt es sich um ein industriell beeinflusstes Grundwasser in dem mehr als 4.000 Features ermittelt werden konnten. Für bekannte Features, beispielsweise die Valsartansäure, ein Transformationsprodukt des Medikamentes Valsartan, ist in Bild 2 (unten) das extrahierte Ionenchromatogramm für die Masse 267,0877 sowie das Massenspektrum und die Strukturformel dargestellt. Der Großteil der Punkte ist aber noch unbekannt. Eine Identifi-zierung aller Punkte ist mit erheblichem Aufwand verbunden und praktisch derzeit unmöglich. Deshalb ist es erforderlich, sich auf ausgewählte, interessante oder relevante Punkte zu fokussieren.



Die Signalintensität ist farblich über der Masse Retentionszeit-Ebene dargestellt. Mittels eines mathematischen Algorithmus gilt es die Features zu erkennen.


 

 

 

 


Industriell beeinflusste Grundwasserprobe:
Die blauen Punkte sind Features bei positiver, die orangen bei negativer Elektrospray-Ionisation



 





Bild 2: LC-HRMS-Chromatogramm (oben) sowie der entsprechende Contour-Plot mit her-ausgezoomten Feature (Mitte links), dem Masse-Retentionszeit-Diagramm (Mitte rechts) und das Chromatogramm eines extrahierten Features mit der Masse 267,0877 ± 0,0025 m/z (un-ten) sowie dem Massenspektrum von Valsartansäure

Workflow

In Bild 3 sind zwei mögliche Herangehensweisen, der Suspected-Target- und der Non-Target-Analytik, zum Aufspüren „neuer“ Spurenstoffe aufgezeigt. Bei der Suspected-Target-Analytik hat man bereits gewisse Ideen oder Informationen über das Vorhandensein möglicher Spurenstoffe. Beispielsweise können zur Identifizierung einer Gewässerverunreinigung Informationen über eingesetzte Chemikalien potenzieller Verursacher in einer sogenannten Suspected-Target-Liste zusammengestellt werden und in den LC-HRMS-Chromatogrammen gezielt nach diesen Substanzen gesucht werden.

Bild 3: Workflow zur Auswertung in der Non-Target-Analytik

Bei der Non-Target-Analytik versucht man durch Anwendung von statistischen Methoden und Vergleich von mehreren Wasserproben Auffälligkeiten in den „Punktwolken“ zu ermitteln. Eine solche Auffälligkeit kann beispielsweise das Auftreten einzelner Features mit erhöhter Intensität nur in bestimmten Proben einer Zeitreihe sein.


Fallbeispiel Suspected-Target-Analytik - Aufspüren von Transformationsprodukten

Das Vorkommen von Arzneimitteln in der aquatischen Umwelt ist ein Schwerpunktsthema in der Umweltanalytik. Besonders deren Funde im Ablauf von Kläranlagen und durch den Was-serkreislauf bedingt auch in Flüssen und im Grundwasser, haben dazu geführt, dass über eine zusätzliche Reinigungsstufe (die sog. 4. Reinigungsstufe) bei den Kläranlagen intensiv diskutiert und geforscht wird. In diesem Zusammenhang ist die Bildung von Umwandlungs-produkten (Transformationsprodukten) in der Kläranlage oder im Oberflächengewässer von sehr großem Interesse.
Beim Aufspüren solcher Transformationsprodukte in der Umwelt kann die Suspected-Target-Analytik hilfreich sein. Durch theoretische Überlegungen von möglichen Reaktionen der Arz-neimittel in der Umwelt lassen sich Vorschläge für solche Transformationsprodukte machen. Anhand der exakten Masse für die Vorschläge können dann die LC-HRMS-Chromatogramme von Wasserproben auf die Hinweise dieser Transformationsprodukte un-tersucht werden. Dies ist in Bild 4 für Transformationsprodukte von Valsartan dargestellt. Tritt in einer Wasserprobe Valsartan auf, so ist es sinnvoll auf die Transformationsprodukte Deal-kyliertes Valsartan, Valsartansäure und Aminovalsartan zu schauen. In Bild 4 sind die zuge-hörigen Ionenchromatogramme dargestellt. Das Auftreten eines chromatographischen Peaks bei der exakten Masse des Transformationsprodukts ist ein Hinweis, der dann durch das Isotopenmuster und Massenspektren bestätigt werden muss.

Bild 4: Extrahierte Ionenchromatogramme aufgrund möglicher Transformationsprodukte von Valsartan am Beispiel einer Donau-Wasserprobe

Fallbeispiel Non-Target-Analytik - Kontamination des Grundwassers

Grundwasser ist in Deutschland die wichtigste Ressource für Trinkwasser. Deshalb ist es wichtig das Grundwasser vor anthropogenen Einflüssen zu schützen. Die Non-Target-Analytik kann helfen, Kontaminationen zu erkennen und u. U. diese dann auch Quellen zu-zuordnen. Bei dem in Bild 5 dargestellten Beispiel handelt es sich um ein Wasserwerk, das Grundwasser aus verschiedenen Brunnen A und B zur Trinkwasseraufbereitung nutzt. Im Bereich des Grundwasserzustroms liegt eine gesicherte Deponie. Zur Kontrolle möglicher Infiltrationen aus der Deponie in das Grundwasser wurde eine Grundwassermessstelle D im Abstrom eingerichtet. Die Aufgabenstellung bestand darin, zur ermitteln, ob es einen Einfluss durch die Deponie auf das Grundwasser und in der Folge auf die Trinkwasserversorgung gibt. Diese Fragestellung kann mit Hilfe der Non-Target-Analytik gelöst werden, obwohl im Vorfeld weder die Substanzen noch deren Verhalten im Grundwasser auf dem Weg zu den Brunnen bekannt ist.

Bild 5: Schematische Darstellung der Anwendung der Non-Target-Analytik zur Erkennung von Kontaminationen des Grundwassers durch eine Deponie

In Bild 5 sind Ausschnitte der Masse-Retentionszeit-Diagramme für die einzelnen Probe-nahmestellen dargestellt. Substanzen, die aus der Deponie in das Grundwasser infiltrieren, müssen somit als Punkte in D und A auftauchen. Mathematisch kann die „Punktwolke“ als eine Menge und das gemeinsame Auftreten von Features als Schnittmenge der beiden Mengen (siehe Bild 5) betrachtet werden. Da das Grundwasser im Anstrom zur Deponie u. U. bereits organische Spurenstoffe enthalten kann, die nicht aus der Deponie stammen, ist von der Schnittmenge A und D (A ∩ D) noch das Ergebnis der unbeeinflussten Wasserprobe aus B abzuziehen ((A ∩ D)\B). Diese Vorgehensweise ermöglicht es, von ca. 1700 Features im Wasser der Grundwassermessstelle D genau 11 Features herauszufiltern, die noch im Rohwasser des Wasserwerks erscheinen. Diese müssen noch durch Messung des MS/MS-Spektrums und Vergleich mit Referenzsubstanzen identifiziert werden. Dies kann sehr zeit-aufwändig sein. In diesem Beispiel konnten bisher von den 11 Features 3 identifiziert werden. Es handelt sich um 1-Adamantylamin, Crotamiton und Carbamazepin.


Fallbeispiel Non-Target Analytik - Einleitung in ein Oberflächengewässer

Die Oberflächengewässer wie beispielsweise Rhein, Donau und Elbe dienen der Binnen-schifffahrt als Verkehrsweg und stellen den Vorfluter für die Einleitung der gereinigten Ab-wässer aus kommunalen- und industriellen Kläranlagen dar. Über diese und andere Wege können organische Spurenstoffe ungewollt in die Flüsse gelangen. Für den Analytiker be-deutet dies im ungünstigsten Fall, dass er weder die Substanzen noch den Zeitpunkt deren Freisetzung kennt. Dies ist ein Paradebeispiel für die Anwendung der Non-Target-Analytik.
Die tägliche Untersuchung einer Flusswasserprobe mittels LC-HRMS und der Vergleich der Masse-Retentionszeit-Diagramme zeitlich aufeinander folgender Proben kann unerwartete Substanzen aufdecken. Hier können aber auch statistische Methoden helfen, Besonderheiten oder Auffälligkeiten in einem Kollektiv von Proben zu erkennen (siehe Bild 3 Non-Target-Workflow). Eine dieser sogenannten multivariaten statistischen Methoden ist die Hauptkom-ponentenanalyse (engl. Principal Component Analysis, PCA).

Bild 6 (oberer Teil) zeigt die prinzipielle Vorgehensweise. Die Datenmatrix X enthält in den Spalten die Signalintensitäten der ermittelten Features in der Probe. Jede Spalte stellt eine Probe und jede Zeile ein Feature dar. Wenn ein Feature in einer Probe nicht erscheint, so ist die Intensität Null. Eine Datenmatrix X kann aus mehreren tausend Zeilen und aus hunderten von Proben bestehen. In einer solchen Datenmenge ohne statistische Hilfsmittel Auffälligkeiten zu erkennen, ist nahezu unmöglich. Durch Anwendung der PCA ist es möglich, solche Auffälligkeiten zu ermitteln. In Bild 6 (unterer Teil) ist ein Teilergebnis der PCA in Form des soge-nannten Score und Loading Plots dargestellt. Im Score Plot liegen die rot markierten Proben deutlich von den restlichen getrennt vor, d. h. sie unterscheiden sich in einer Eigenschaft von den anderen Proben. Die Ursache für den Unterschied ergibt sich aus dem Loading Plot in dem die Features eingetragen sind. Die abweichenden Proben liegen im Score Plot rechts unten und somit sind die Features im Loading Plot die rechts unten liegen für diese Lage wesentlich verantwortlich.

 


Bild 6: Prinzip der Hauptkomponentenanalyse (oben) und Ergebnis in Form des Score Plots (links unten) und des Loading Plots (rechts unten).

Es gilt nun den Intensitätsverlauf dieser Features über die Proben zu betrachten. Für die rot eingerahmte Masse von 308,185 m/z ist dies in Bild 7 (oben) dargestellt. Deutlich ist hier eine Einleitung in das Oberflächengewässer über einen Zeitraum von ca. 10 Tagen zu erkennen. Die Identifizierung der Substanz ergab Buflomedil mit einer maximalen Konzentration im Flusswasser von ca. 200 ng/L.

   

Bild 7: Intensitätsverlauf (Doppelmessung) einer Substanz über einen Monat (oben) und Identifizierung über Summenformel und Massenspektrum (unten)

Zusammenfassung

Anhand der Fallbeispiele wird gezeigt welches analytische Potenzial die Non-Target-Analytik beim Aufdecken neuer Spurenstoffe bietet. Durch die LC-HRMS hat der Analytiker die Mög-lichkeit, zumindest teilweise, die Frage zu beantworten: „Welche Substanzen sind in der Wasserprobe?“. Voraussetzung hierfür ist, dass die Substanzen chromatographierbar und mit der Elektrospray-Ionisation ionisierbar sind. Werden die Ergebnisse in einem Masse-Retentionszeit-Diagramm dargestellt, so ergeben sich je nach Wasserprobe mehrere hundert bis mehrere tausend Punkte. Aufgrund dieser großen Anzahl an Punkten ist es für die Identi-fizierung der Substanzen erforderlich, sich auf relevante Punkte zu beschränken. Deshalb sind Probenbegleitinformationen von großer Wichtigkeit. So ist es möglich, über die Suspec-ted-Target-Analytik gezielt nach beispielsweise Arzneimitteln oder fischtoxischen Substanzen zu suchen. Die Anwendung von statistischen Methoden bei der Suche nach Auffälligkeiten in den Proben ist ein wichtiges Hilfsmittel. Die Non-Target-Analytik wird in den nächsten Jahren weiter an Bedeutung gewinnen.

Literatur

[1] Schulz, W., Seitz, W., Lucke, T. (2014): Massenspektrometrie in der organischen Spu-renanalytik, Aktuelle Wochenschau der GDCh, 21. Februar

[2] Müller, A., Schulz, W., Ruck, W.K.L., Weber, W.H. (2011): A new approach to data eval-uation in the non-target screening of organic trace substances in water analysis, Chemo-sphere, 85, 1211–1219

[3] Schulz, W., Schreiber, A. (2011): Combining a fast and powerful LC-TOF-MS method for water screening with advanced software tools to identify pesticides and their metabolites, Spectroscopy Europe 23 (6), 18-23

[4] Müller, A., Schulz, W., Ruck, W. K. L., Weber, W.H. (2010): Einsatz des Non-Target-Screenings zur Erkennung von Spurenstoffeinträgen in das Rohwasser einer Trinkwas-serversorgung, Poster und Tagungsbandbeitrag, Jahrestagung der Wasserchemischen Ge-sellschaft, Bayreuth, 10. – 12. Mai, ISBN 978-3-936028-63-8