Die Analyse unerwünschter Wirkungen von Substanzen im 21. Jahrhundert

Einleitung

Verbesserte Methoden der chemischen Analytik zeigen die Belastung von Umweltproben, Lebensmitteln und Gegenständen des täglichen Bedarfs durch eine Vielzahl von chemischen Substanzen. Dabei handelt es sich um zum Beispiel um Rückstände von Industriechemikalien, Pflanzenschutzmitteln oder (veterinär)medizinischen Produkten, die über Prozessabwässer, durch Kläranlagenabläufe oder direkt von landwirtschaftlich genutzten Flächen in die Umwelt, vor allem ins Wasser, gelangen. Die Erfassung der Gefährdung von Ökosystemen und Menschen, die von diesen Belastungen ausgeht, durch die traditionellen, von der OECD vorgeschriebenen Toxizitätstests durch Tierversuche erscheinen heute vielfach nicht mehr angemessen. Diese Tests stammen aus einer Zeit, als über die biologischen Grundlagen toxischer oder unerwünschter Wirkungen noch wenig bekannt war. Durch die Exposition von Tieren, wie Mäusen, Ratten, Fischen oder Daphnien, konnten erste Informationen zu toxischen Wirkungen von Chemikalien und ihrer Dosisabhängigkeit gesammelt und so Risikobewertungen vorgenommen werden. Die Beurteilung der Gefährdung durch die in der Praxis oft eher relevanten niedrigen Konzentrationen erfolgt durch Extrapolation, was durchaus kritisch betrachtet werden muss. Zudem ist nicht sichergestellt, dass Ergebnisse, die mit einem Versuchstier gewonnen werden, auch für andere Lebewesen relevant sind. Vor diesem Hintergrund werden daher schon seit mehreren Jahren Alternativen zu Tierversuchen gesucht, mit deren Hilfe unerwünschte oder toxische Wirkungen vorhergesagt werden können.  


Alternativen zu Tierversuchen

In den vergangenen Jahrzehnten haben sich die Kenntnisse über die Mechanismen in biologischen Systemen erweitert, so dass heute zum Beispiel in vitro Kultivierungen von Zellen als organähnliche Systeme mit den entsprechenden physiologischen Funktionen möglich sind. Für toxikologische Untersuchungen heißt das, dass durch die Kombination von Zellsystemen und den entsprechenden Stimuli die unterschiedlichen Funktionen der einzelnen Organe eines Körpers und damit die Komplexität von Lebewesen simuliert werden können. Gravierende Störungen der physiologischen Funktionen führen zu den unterschiedlichen toxischen Effekten oder unerwünschten Wirkungen. Die zugehörigen Reaktionskaskaden im Organismus werden als Toxizitätspfade (toxicity pathway, TP) bezeichnet. Angestrebt wird die Identifizierung aller wesentlichen Toxizitätspfade in einem Organismus, da künftige Toxizitätstests dann gezielt Störungen dieser Toxizitätspfade erfassen könnten. Der Toxizitäts – Mechanismus in einem zellulären System ist also mit der Wirkung auf das Organ, den gesamten Organismus und sogar die gesamte Population zu koppeln (Abb. 1).

Außerdem können auch über Zellkultursysteme toxikokinetische Parameter, also die Aufnahme in den Körper, die Verteilung im Körper, die metabolische Umsetzung und die Ausscheidung (ADME), von Chemikalien abgeschätzt werden. Dies wird unterstützt durch in silico Methoden, wie zum Beispiel die Etablierung von quantitativen Struktur-Wirkungs-Beziehungen ((Q)SAR) durch Nutzung von Datenbanken über chemische Strukturen und ihre biologischen Wirkungen.


Umfassende molekulare Analyse: Omics-Methoden

Ausgangspunkt von Toxizitätspfaden ist die Wechselwirkung von chemischen Substanzen mit einem molekularen Angriffspunkt (Target) in einer Zelle. Dies führt zur Antwort der Zelle zum Beispiel durch veränderte Nutzung von (einzelnen) Genen oder Anpassungen der Aktivität von (spezifischen) Proteinen und damit einem veränderten Metabolismus. Zur Erfassung der Antworten eines Zellsystems sind daher analytische Methoden notwendig, mit denen die Veränderungen auf genetischer Ebene (Genomic und Transcriptomics), bei den Proteinen (Proteomics) und bei den Metaboliten (Metabolomics) in einem Organismus ohne spezifische Vorgaben und Einschränkungen („non-Target“) quantitativ bestimmt werden können. Diese sogenannten „omics“-Methoden sind vielfach mit den Begriffen „DNA-Microarrays“ oder „2D-Gelelektrophorese“ eng verknüpft. Das Potenzial der mit diesen Methoden durchgeführten Untersuchungen konnte jedoch nur bei den (wenigen) Organismen annähernd ausgeschöpft werden, von denen die Genome sequenziert worden waren. Seit wenigen Jahren sind nun neue Sequenziertechnologien für Nukleinsäuren verfügbar („next generation sequencing“), die die Sequenzierung von Genomen deutlich beschleunigt haben. Gleichzeitig ist es nicht mehr notwendig, mit den Genom-Informationen organismenspezifische DNA-Microarrays zu fertigen, da auch das Transcriptom durch Sequenzierung ermittelt werden kann. Im Bereich der Protein- und Metabolitenanalyse wurden massenspektrometrische Methoden so weit entwickelt, dass die Identifizierung und Quantifizierung der jeweiligen Analyte auch bei geringen Konzentrationen deutlich verbessert wurden. Damit stehen heute analytische Methoden zur Verfügung, mit denen die molekularen Antworten zellulärer Systeme auf chemische Stressoren umfassend quantitativ erfasst werden können.


Systemtoxikologie

Um aus der Vielzahl dieser einzelnen molekularen Datenpunkte, die nach Exposition eines zellulären Systems mit einer Probe erhalten werden, auf unerwünschte Effekte auf die behandelten Zellen, den gesamten Organismus und schließlich die Population oder sogar das Ökosystem schließen zu können, müssen diese Datenpunkte mit den Toxizitätspfaden (Abb. 1) in Beziehung gebracht werden. Dies führt zur Konstruktion von biologischen Netzwerken, in denen Ursachen und Wirkungen von Reaktionen in einer Zelle und in einem komplexeren Organismus miteinander verknüpft sind und deren Struktur und Dynamik durch mathematische Algorithmen beschrieben werden kann. Die Exposition eines zellulären Systems gegenüber einer (toxischen) Chemikalie führt zu Störungen dieser Netzwerke in Abhängigkeit von der Konzentration der Chemikalie und der Expositionsdauer. Mathematische Modelle sollten jedoch nicht nur die molekularen Auswirkungen einer Störung dieser Netzwerke vorhersagen, sondern auch die Konsequenzen für andere Organe berücksichtigen, also die Wechselwirkungen von Organfunktionen in einem komplexen Organismus simulieren. Damit wären dann Vorhersagen zu toxischen Wirkungen auf einen komplexen Organismus, und sogar eine gesamte Population möglich.


Jedoch ist derzeit von vielen biologischen Komponenten (Proteine, Gene, Metabolite) die Funktion und Position im biologischen Netzwerk selbst eines zellulären Systems nicht genau bekannt. Damit erscheint dieser systemtoxikologische Ansatz, der ja auch noch Organe, komplexe Organismen und ganze Populationen und Ökosysteme umfasst, wenig erfolgversprechend. Es hat sich jedoch bereits für einige Anwendungen gezeigt, dass es nicht absolut notwendig ist, alle Komponenten eines Netzwerkes in einem biologischen System im Detail zu kennen, um relevante Informationen zu erhalten. So werden neue Substanzen vielfach anhand von Genexpressions (Transkriptom)- oder von Proteinprofilen von Referenzsubstanzen klassifiziert, um Hinweise auf Wirk - oder Toxizitätsmechanismen zu erhalten, ohne dass die funktionelle Verknüpfung aller Komponenten des Profils bekannt sein muss. Auf der Basis dieser Informationen kann bereits eine erste, empirische Risikoabschätzung vorgenommen werden.


Die erhaltenen, charakteristischen Profile werden auch als „Signaturen toxischer Mechanismen“ bezeichnet. Sie enthalten jedoch nicht nur Informationen über den toxischen Mechanismus sondern auch über Anpassungs- und Abwehrreaktionen des Organismus. Gelingt es zum Beispiel mit Hilfe biochemischer und molekularbiologischer Methoden, diese aufzuklären, können den toxischen Signaturen Toxizitätsmechanismen (Pathways of toxicity) zugeordnet werden, die in ihrer Kombination letzten Endes zum Systemverständnis führen (Abb. 2).

Komplexe Ökosysteme: Wie verlässlich können unerwünschte Wirkungen vorhergesagt werden?

Ökologische Effekte, die nach der breiten Anwendung des Insektizids Imidacloprid auftraten, zeigen auf, wie es zu Fehleinschätzungen der Gefährdung von Ökosystemen kommen kann, auch wenn umfangreiche mechanistische Daten vorliegen. Imidacloprid gehört in die Gruppe der Neonikotinoide, die auf den Acetylcholinrezeptor von Zellen des zentralen Nervensystems von Insekten wirken. Saatgut wird direkt mit Imidacloprid beschichtet, da das Insektizid gut in alle Bestandteile der Pflanze eingebaut wird und auf diese Weise systemisch wirkt. Die Konzentrationen können sehr viel niedriger sein als bei herkömmlichen Insektiziden, und die Anwendung über Aufsprühen auf die Pflanzen wird vermieden. Imidaclopromid ist gut wasserlöslich, wird wenig von Bodenpartikeln adsorbiert und hat in Oberflächenwasser eine kurze Halbwertszeit, kann aber in Grundwasser akkumulieren. Die Affinität zum Acetylcholinrezeptor von anderen Lebewesen als  Insekten ist schwächer, was zur geringen toxischen Wirkung zum Beispiel auf Menschen führt. Moderne molekularbiologische Methoden und Anwendung der neuen Hoch-Durchsatz-Sequenziertechnologien zeigten, dass in resistenten Organismen zum Beispiel die Aktivität von Entgiftungsenzymen erhöht ist.


Trotz dieser umfangreichen mechanistischen Kenntnisse wurde Imidacloprid bereits wenige Jahre nach seiner Markteinführung für einzelne Anwendungsfelder in Frankreich und später auch in Deutschland und anderen Ländern wieder verboten. Hintergrund war ein gravierendes Sterben von Bienenvölkern, das auf die Nutzung Imidacloprid-behandelter Pflanzen durch die Bienen zurückgeführt wurde. Außerdem zeigte eine neue Studie in den Niederlanden, dass die Population frei lebender Vögel kontinuierlich abnahm, wenn die Imidacloprid-Konzentration in der Umwelt einen Wert von nur 20 ng/L überstieg. Dies wurde nicht auf direkte toxische Effekte von Imidacloprid zurückgeführt, sondern auf einen indirekten Effekt, da vor allem während der Aufzucht der Jungvögel die als Futter notwendigen Insekten fehlen.


Dieses Beispiel vom Imidacloprid zeigt, dass auch bei Vorliegen umfangreicher Datensätze und mechanistischer Informationen unerwartete ökologische Wirkungen möglich sind. Im hier beschriebenen Beispiel war die Ursache nicht in möglicherweise nicht vollständigen Datensätzen oder der Art, wie sie erhoben wurden, zu suchen. Vielmehr war das zu betrachtende System nicht ausreichend weit gefasst worden. Vögel waren zwar im Hinblick auf direkte toxische Effekte untersucht worden, aber indirekte Effekte, zum Beispiel nach einem Jäger – Beute – Modell, fehlten in den Analysen.


Jede Vorhersage von Wirkungen auf ein System ist also nur so gut wie die Beschreibung des Systems und die Berücksichtigung seiner Komponenten. Dies gilt jedoch nicht nur für die modernen mechanistischen Ansätze in der Bewertung der Gefährdung durch Chemikalien, sondern auch für die klassischen Methoden.

Literatur

Altenburger, R. Scholz, S., Schmitt-Jansen, M., Busch, W., Escher, B.I. (2012) Mixture Toxicity revisited from a Toxicogenomic Perspective, EST 46, 2508 – 2522

Ankley, G.T. et al. (2010) Adverse Outcome Pathways: A conceptual framework to support ecotoxicology research and risk assessment, Env. Toxicol. Chem. 29, 730 – 741

European Food Safety Authority (2014) Modern methodologies and tools for human hazard assessment of chemicals, EFSA J. 12(4) 3638

Hallmann, C.A., Foppen R.P.B., van Turnhout, C.A.M., de Kroon, H., Jongejans, E. (2014) Declines in insectivorous birds are associtade with high neonicotinoid concentrations, Nature 13531, on-line

Hartung, T., van Vliet, E., Jaworska, J., Bonilla, L., Skinner, N., Thomas, R. (2012) Food for Thought: Systems Toxicology, ALTEX, 29, 119 - 128

Kaljdzic, P. et al. (2012) Use of mutagenesis, genetic mapping and next generation transcriptomics to investigate insecticide resistance mechanisms, Plos One, 7, e40296

Kleinstreuer N.C. et al., (2014) Phenotypic screening oft he ToxCast chemical library to classify toxic and therapeutic mechanisms, Nature Biotechnol. 32, 583 – 591

Sturla, S.J., Boobis, A.R., FitzGerald, R.E., Hoeng, J., Kavlock, R.J., Schirmer, K., Whelan, M., Wilks, M.F., Peitsch, M.C. (2014) Systems Toxicology: From Basic Research to Risk Assessment, Chem. Res. Toxicol. 27, 314 – 329

Zhang, Y., Jiang, R., Wu, H., Liu, P., Xie, J., He, Y., Pang, H. (2012) Next-generation sequencing-based transcriptome analysis of Cryptolaemus montrouzieri under insecticide stress reveals resistance-relevant genes in laybirds, Genomics, 100, 35 - 41