Schadstoffspuren Monitoring mit Biosensoren am Beispiel Diclofenac

Pharmakologisch aktive Substanzen werden zunehmend in der Umwelt, wie beispielsweise in Oberflächengewässern nachgewiesen und können potentiell schon in geringen Konzentrationen diese aquatischen Ökosysteme nachhaltig verändern [1,2]. Die Europäische Union hat auf die Problematik der Existenz pharmakologisch aktiver Substanzen in Oberflächengewässern mit einer Änderung der Europäischen Wasserrahmenrichtlinie reagiert und 17-beta-Östradiol, 17-alpha-Ethinylöstradiol und Diclofenac als erste Arzneimittelstoffe in die Beobachtungsliste aufgenommen [3].


Diclofenac, ein nichtsteroidales Antirheumatikum, wird in großen Mengen in der Human- und Veterinärmedizin eingesetzt, da es nicht nur schmerzlindernd, entzündungshemmend und fiebersenkend wirkt [4], sondern auch preiswert herzustellen ist. Durch menschliche oder tierische Ausscheidungen sowie durch unsachgerechte Entsorgung gelangt Diclofenac in die Oberflächengewässer, da es bei der Abwasserreinigung in Kläranlagen oftmals nur unvollständig entfernt wird [5]. Mittlerweile ist es deshalb in Spurenkonzentrationen in vielen Oberflächen-gewässern bis zu einer Konzentration von 1,2 µg L-1 nachweisbar [6] und steht unter Verdacht, Nierenschäden in Fischen hervorzurufen [7].


Zur Einschätzung des damit verbundenen human- und ökotoxikologischen Risikopotentials sind geeignete quantitative Nachweisverfahren erforderlich, die auch in komplexen Matrices sensitive und selektive Messungen erlauben. Im Idealfall sollten diese möglichst schnell und preiswert sein.
Biosensoren sind miniaturisierte Messgrößenaufnehmer, deren biologische Er-kennungsstruktur (Antikörper, Enzyme, Aptamere, Rezeptoren…) unmittelbar an einen geeigneten Signalwandler (Transducer) gekoppelt ist. Wechselwirkt der Analyt mit der selektiven Erkennungsstruktur, wird ein physikochemisches Signal erzeugt, welches durch den Transducer in ein elektrisch auswertbares Messsignal umgewandelt wird.


Biosensoren bieten in der Umweltanalytik viele Vorteile gegenüber konventionellen analytischen Routinemethoden wie der GC-MS/MS oder der LC-MS/MS. So ist beispielsweise der Probenvorbereitungsaufwand als gering einzuschätzen und es besteht die Möglichkeit von vor-Ort Messungen. Zum Nachweis und zur Quantifizierung von Diclofenac in Oberflächengewässern sind optische Biosensoren bisher aber kaum in der Literatur beschrieben [8]. Deshalb wurde mit Hilfe der markierungsfreien Reflektometrischen Interferenzspektroskopie (RIfS) ein Immunosensor (Antikörper als Erkennungsstruktur) entwickelt, um Diclofenac in belasteten Oberflächengewässern qualitativ und quantitativ nachzuweisen.

 
Die Reflektometrische Interferenzspektroskopie beruht auf dem Prinzip der Mehrfachreflexion von Weißlicht an dünnen Schichten [9]. Hierfür wird der transparente Transducer von der Rückseite mit Weißlicht bestrahlt (Abb. 1). An jeder Grenzschicht wird ein Teil des Lichts transmittiert und ein Teil reflektiert. Die reflektierten Teilstrahlen interferieren und bilden ein charakteristisches Interferenzspektrum. Auf der Oberfläche des Transducers befindet sich die sensitive Schicht, welche mit der Erkennungsstruktur in Wechselwirkung treten kann. Dabei ändert sich sowohl der Brechungsindex n, als auch die physikalische Schichtdicke d dieser Schicht. Das Interferenzspektrum wird zu höheren Wellenlängen verschoben. Durch Verfolgung eines prominenten Punktes, z.B. eines Extrempunktes, kann aus dessen Verschiebung auf die Änderung der optischen Schichtdicke (Produkt aus physikalischer Schichtdicke und Brechungsindex) geschlossen werden. Damit ist es möglich, biomolekulare Interaktionen nicht nur qualitativ, sondern auch quantitativ zu bestimmen. 

 

<br />Abbildung 1: Prinzip der RIfS: Verschiebung des Interferenzspektrums zu höheren Wellenlängen bei Wechselwirkungsvorgängen mit der sensitiven Schicht. Ein zeitabhängiges Bindungssignal wird erhalten (rechts).

Oberflächenwasser enthält eine Vielzahl von gelösten und partikulär gebundenen Substanzen sowie ungelösten Stoffen, die sowohl einzeln als auch in Kombination Matrixeffekte verursachen können. So könnte beispielsweise die Analyt-Antikörper Wechselwirkung durch unspezifische Adsorption an einen der beiden Wechselwirkungspartner gestört oder das Messsignal durch unspezifische Wechselwirkungen von Matrixbestandteilen mit der Oberfläche des Biosensors verfälscht werden. Demzufolge muss bei der Entwicklung des Immunosensors verstärkt auf die Reduzierung oder Vermeidung von Matrixeffekten durch optimierte Assaybedingungen geachtet werden.


Bevor Messungen in der komplexen Probenmatrix Oberflächenwasser durchgeführt wurden, wurde in einem ersten Schritt der Immunoassay in Puffer entwickelt und etabliert. Dabei wurde vor allem auf eine hohe Sensitivität des Immunoassays, eine hohe Spezifität und Reproduzierbarkeit des Signals und auf eine gute Regenerierbarkeit der Oberfläche großen Wert gelegt. Basierend auf diesen optimierten Bedingungen wurde der Immunosensor in Puffer kalibriert (Abb. 2) und eine Nachweisgrenze von 0,284 µg L-1 sowie eine Bestimmungsgrenze von 0,493 µg L-1 erhalten. Mittels guter Wiederfindungsraten konnte die Kalibrierkurve erfolgreich validiert werden.

<br />Abbildung 2: Kalibrierkurve in Puffer (Dreifachmessungen).

Im Anschluss wurde der Immunosensor in ultrafiltriertem entsalztem Wasser kalibriert. Da Antikörper empfindliche Biomoleküle darstellen, die in Wasser als Probenmatrix möglicherweise nach einiger Zeit denaturieren, musste hierbei die Messroutine angepasst werden. Der Einfluss verschiedener Matrixbestandteile wie beispielsweise der von verschiedenen Huminsäure-Konzentrationen auf die Oberfläche, auf den Antikörper sowie den Analyt und somit auf die Analyt-Antikörper-Wechselwirkung wurde untersucht. Bis zu einer Huminsäure-Konzentration von 1,5 mg L-1 konnte kein Einfluss beobachtet werden. Für einen direkten optischen Immunoassay stellt dies ein sehr gutes Ergebnis dar.

 
Aus Flüssen wie der Nagold, der Großen Enz oder der Enz wurde Flusswasser entnommen. In allen Flusswasserproben lag die Diclofenac-Konzentration unter der Nachweis- und Bestimmungsgrenze des hier beschriebenen Immunosensors. Die entnommenen Flusswasserproben wurden aus diesem Grund filtriert, gespiked und die Diclofenac-Konzentration bestimmt. In allen Gewässerproben wurden gute Wiederfindungsraten erreicht (Abb. 3, am Beispiel: Nagold Flusswasser).

<br />Abbildung 3: Wiederfindungsraten in filtriertem, gespiktem Nagold Flusswasser. Es wurden vier Diclofenac Konzentrationen bestimmt (0,56 µg/L; 1,11 µg/L; 1,48 µg/L; 1,86 µg/L).

Um Probenvorbereitung zu vermeiden, wurden Messungen auch in unfiltriertem gespikten Flusswasser durchgeführt. Auch hier wurden gute Wiederfindungsraten erhalten.
Demzufolge konnte ein markierungsfreier optischer Biosensor zum Nachweis und zur Quantifizierung von Diclofenac in belasteten Oberflächengewässern erfolgreich entwickelt und etabliert werden. Da durch Optimierungen des Assays Matrixeffekte reduziert werden konnten, ist eine Probenvorbereitung der Oberflächengewässer-proben nicht von Nöten.

Literatur

[1] D.W. Kolpin et al., Pharmaceuticals, hormones, and other organic wastewater contaminants in U.S. streams, 1999-2000: a national reconnaissance, Environ Sci Technol 36, 1202-1211 (2002); doi: 10.1021/es011055j

[2] M. Petrovic et al., Endocrine disrupting compounds and other emerging contaminants in the environment: A survey on new monitoring strategies and occurrence data, Anal Bioanal Chem 378, 549-562 (2004); doi: 10.1007/s00216-003-2184-7

[3] Richtlinie 2013/39/EU des Europäischen Parlaments und des Rates vom 12. August 2013 zur Änderung der Richtlinien 2000/60/EG und 2008/105/EG in Bezug auf prioritäre Stoffe im Bereich der Wasserpolitik (2013)

[4] E.C. Ku et al., Diclofenac sodium (GP 45840, Voltaren), a potent inhibitor of prostaglandin synthetase, Biochem Pharmacol 24, 641-643 (1975)

[5] S. Wiegel et al., Pharmaceutics in the River Elbe and its tributaries, Chemosphere 57, 107-126 (2004); doi: org/10.1016/j.chemosphere.2004.05.017

[6] T.A. Ternes, Occurrence of drugs in German sewage treatment plants and rivers, Water Research 32 (11), 3245-3260 (1998); doi: 10.1016/S0043-1354(98)00099-2

[7] J. Schwaiger et al., Toxic effects of the non-steroidal anti-inflammatory drug diclofenac Part I:histopathological alterations and bioaccumulation in rainbow trout, Aquat Toxicol 68, 141-150 (2004); doi: 10.1016/j.aquatox.2004.03.014

[8] A. Deng et al., Residue analysis of the pharmaceutical diclofenac in different water types using ELISA and GC-MS, Environ Sci Technol 37, 3422-3429 (2003); doi: 10.1021/es0341945

[9] S. Rau et al., Reflectometric interference spectroscopy (RIfS) as a new tool to measure in the complex matrix milk at low analyte concentration, Anal Bioanal Chem 402, 529-536 (2012); doi: 10.1007/s00216-011-5470-9