Unterstützung für die klassische Mikrobiologie - Anpassung eines molekularbiologischen Verfahrens für die hygienische Kontrolle in der Trinkwasseraufbereitung

Die konventionellen Verfahren der hygienischen Trinkwasserüberwachung basieren auf der Anzüchtung von Mikroorganismen auf speziellen Nährmedien. Je nach untersuchter Bakterienart kann diese Nachweismethode mehrere Tage in Anspruch nehmen.
Durch Desinfektionsmaßnahmen oder bei Verwendung von Kupfer im Rohrleitungsnetz können Bakterien in einen nicht-kultivierbaren Zustand übergehen. Diese Bakterienstadien werden von den Kultur-basierten Nachweisverfahren „übersehen“.
Als eine schnellere Alternative zur herkömmlichen Analytik, die auch nicht-kultivierbare Bakterien detektiert, werden im Rahmen einer Promotion molekularbiologische Verfahren weiterentwickelt. Diese Verfahren basieren auf dem Nachweis von Nucleinsäuren mit Spezies-spezifisch unterschiedlichen Sequenzen innerhalb der Bakterienzellen. Zu diesen Verfahren zählen Methoden auf Basis der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) wie auch der Fluoreszenz in-situ Hybridisierung (FISH) [1, 2].


Sowohl bei der Untersuchung von Proben aus dem medizinischen Umfeld wie Blut und Urin, als auch bei der Analyse von Biofilmen und oligotrophen, wässrigen Matrices wie Fluss- und Abwasser konnten mit diesen Methoden bereits fundierte Resultate erzielt werden. Für die Bewertung von Trinkwasserresourcen müssen die Bakterienzellen jedoch zunächst durch Filtration über Membranfilter aus der Wasserprobe aufkonzentriert werden. Die Anwendung der FISH in der mikrobiologischen Routinekontrolle der Trinkwasseraufbereitung bedarf jedoch noch einiger Entwicklungsarbeit [1].


So werden zur Identifikation von Bakterien auf Membranfiltern mittels FISH spezifische Nucleinsäure-Sequenzen, zumeist auf der ribosomalen RNA (rRNA), mit fluorenzenzmarkierten Sonden hybridisiert und mikroskopisch ausgewertet. Diese Fluoreszenzmarkierung der rRNA führt bei Stoffwechsel-aktiven Bakterien aufgrund der hohen Anzahl an Ribosomen zu einem starken Signal. Der hierbei verwendete Fluoreszenzmarker Cy3 (Carbocyanin 3) emittiert nach Anregung durch Licht im grünen Spektralbereich eine Rotfluoreszenz. E.coli Zellen leuchten daher nach Hybridisierung mit Cy3 im Fluoreszenzmikroskop rot. Zu Kontrollzwecken wird in der Erprobungsphase zusätzlich ein zweiter, unspezifischer Farbstoff eingesetzt, der sämtliche Zellen in der Probe, unabhängig von der Spezies markiert. Dieser Farbstoff, DAPI (4′,6-Diamidin-2-phenylindol), fluoresziert nach Anregung im UV-Bereich hellblau. Im UV-Kanal betrachtet leuchten also sämtliche E.coli-Bakterien und auch die Bakterien der Begleitflora in einer Probe hellblau. Die spezies-spezifische Markierung von E.coli-Bakterien in Kombination mit einer unspezifischen Färbung sämtlicher Bakterienzellen einer Probe lässt also eine Bestimmung der Gesamtzellzahl einer Probe wie auch eine gleichzeitige Bestimmung der Fäkalindikatorbakterien E.coli zu. Jede doppelt markierte Zelle (blau und rot) ist somit eine E.coli Zelle. Eine einfache DAPI-Markierung (blau) ohne Cy3-Markierung (rot) zeigt eine Zelle der Begleitflora (Abb.1).  

<br />Abb. 1: Doppelmarkierung von Bakterienzellen nach FISH und DAPI-Färbung, zwei Fluoreszenzanregungen des selben Bildausschnitts: A: unspezifische DAPI-Anregung, B: E.coli-spezifische Cy3-Anregung
<br />Abb. 2: DVC-behandelte und DAPI-gefärbte E.coli-Zellen

Da Bakterienzellen in nährstoffarmer Umgebung, wie z.B. Grund- oder Trinkwasser, einen reduzierten Metabolismus aufweisen, verringert sich die Anzahl ihrer Ribosomen und damit auch das spezifische Fluoreszenzsignal in der FISH. Es ist daher zu erwarten, dass eine direkte Korrelation zwischen der Fluoreszenzintensität einzelner Zellen und ihrer Wachstumsrate besteht. Für die Quantifizierung mikrobieller Indikatororganismen in Rein- und Trinkwasser ergibt sich daher zum einen die Notwendigkeit, die nachzuweisenden Bakterien zu reaktivieren um sie mittels FISH detektieren zu können. Zum anderen ist ein zuverlässiger Ausschluss von abgestorbenen Organismen in der FISH essentiell, da prinzipiell auch Ribosomen toter Bakterien noch hybridisiert werden können.

 
In kommerziell erhältlichen Kits zur Analyse nährstoffarmer Wasserproben mittels FISH wird auf einen zeitaufwändigen Vorkultivierungsschritt zurückgegriffen, sodass hierbei anstelle von einzelnen Zellen Mikrokolonien detektiert werden.
Eine andere Methode zur Charakterisierung des physiologischen Zustands einzelner Zellen stellt die Direct Viable Count -Methode (DVC) dar. Bei der DVC-Prozedur werden die Bakterienzellen einem Antibiotikum-haltigen Nährmedium ausgesetzt, sodass die Zellen wachsen, ohne sich jedoch zu teilen. Elongierte Zellen werden dabei als aktiv betrachtet, Zellen die kein Längenwachstum zeigen werden als inaktiv angesehen (Abb.2).

Die Kopplung von DVC und FISH erlaubt zum einen, zwischen toten und lebenden Bakterien zu unterscheiden, wie dies auch in ähnlicher Form bei den klassischen Kultivierungsverfahren der Fall ist. Außerdem führt sie dazu, dass durch die Wachstumsprozesse vermehrt Ribosomen gebildet werden und auch ursprünglich dormante Zellen im Mikroskop leicht zu detektieren sind. Nach DVC-FISH lässt sich eine Bakterienzelle also vier verschiedenen Populationen zuordnen: Aktiven Zellen oder inaktiven Zellen, sowie E.coli-Bakterien oder Begleitflora. Daher entspricht also jede mindestens 1,5-fach verlängerte, in beiden Fluoreszenzkanälen leuchtende Zelle einer aktiven E.coli-Zelle. Jede ausschließlich im DAPI-Kanal fluoreszierende, verlängerte Zelle entspricht einem aktiven Bakterium der Begleitflora (Abb. 3). Sämtliche, nicht verlängerte Zellen gelten als inaktiv.

<br />Abb. 3: DVC-FISH-behandelte E.coli-Zellen und Begleitflora. A: DVC+DAPI, B: DVC+FISH-Sonde

Für die gezeigten Resultate wurden Wasserproben gezielt mit Mikroorganismen aus Laborkulturen versetzt. Es ließen sich vergleichbare Ergebnisse beim Einsatz von Stämmen aus Realproben erzielen.
Im weiteren Projektverlauf sind Versuchsreihen zum Vergleich der entwickelten Methode mit den klassischen Kultivierungsverfahren geplant.
Um bei geringen Zellzahlen eine statistische Vergleichbarkeit der DVC-FISH Methode mit den Verfahren der klassischen Mikrobiologie zu schaffen, ist die Bewertung der gesamten Filterfläche notwendig. Da dies bei manueller, mikroskopischer Auswertung zu aufwändig ist, wird für die kommenden Untersuchungen in einem anderen Teilprojekt des Verbundvorhabens derzeit ein motorisierter Mikroskoptisch für das automatisierte Scanning der Bakterienzellen gebaut.
Die vorgestellten Arbeiten sind ein Teilprojekt im Verbundvorhaben SEKT (Spezifische Detektion von einzelnen Keimen in Rein- und Trinkwasser).
Das Projekt wird gefördert vom Bundesministerium für Bildung und Forschung, Förderkennzeichen: 13N11422.

Literatur

[1] Rompré, A., Servais, P., Baudart, J., de-Roubin, M., and Laurent, P., (2002) Detection and enumeration of coliforms in drinking water: current methods and emerging approaches. Journal of Microbiological Methods  (49): 31-54


[2] Mothershed, E. A. and Whitney, A. M., (2006) Nucleic acid-based methods for the detection of bacterial pathogens: Present and future considerations for the clinical laboratory. Clinica Chimica Acta  (363): 206-220