STED-Mikroskopie – Der einfache Weg zur Superauflösung

Zellstrukturen und Proteine können mittels Fluoreszenzmikroskopie sehr spezifisch abgebildet werden, womit auch Untersuchungen an biochemischen Prozessen in lebenden Zellen möglich sind. Ein Nachteil dieser Methode ist die beugungsbegrenzte räumliche Auflösung der optischen Mikroskopie. Dieses Phänomen, bedingt durch die Welleneigenschaften des Lichts, besagt, dass der Mindestabstand für die Auflösung von Strukturen etwa der Hälfte der Lichtwellenlänge entspricht und wurde von Abbe in seiner grundlegenden Publikation von 1873 beschrieben.[1]

In den letzten Jahrzehnten wurden mehrere Ansätze zur Umgehung dieser Limitation entwickelt und experimentell umgesetzt. Die Herangehensweisen umfassen verschiedenste Konzepte wie zum Beispiel Nahfeldinteraktionen mit Nanometer großen Sonden (near field scanning optical microscopy),[2],[3] Lokalisations- und Rekonstruktionsmikroskopie (PALM, STORM),[4-6] Erstellung von Moiré-Mustern durch Interaktion von stehenden Wellen mit den Probenstruktur (structured illumination microscopy),[7] oder Fernfeldmethoden wie stimulated emission depletion (STED).[8]

STED-Mikroskopie ist eine der ersten Fernfeldtechniken, die Superauflösung ermöglicht, und wurde 1994 von Dr. Stefan W. Hell beschrieben.[8] Zwanzig Jahre später wurden die Arbeiten von Hell, Dr. Eric Betzig und Dr. W. E. Moerner zu superaufgelöster Mikroskopie und STED mit den Nobelpreis für Chemie ausgezeichnet.[9] Heutzutage wird die STED-Technik in Geräten von verschiedenen Herstellern kommerziell angeboten, und deren gesteigerte Benutzerfreundlichkeit ermöglicht deren Anwendung auch außerhalb von hochspezialisierten Laboren.

Die STED-Methode basiert auf der Abregung von angeregten Fluorophoren (fluoreszierenden Substanzen) mit einem Laserstrahl dank stimulierter Emission. Wenn ein angeregtes Fluorophor mit Licht am roten Ende des Fluoreszenzspektrums bestrahlt wird, kann das Molekül zum Übergang in den Grundzustand durch Aussenden eines Photons mit exakt derselben Wellenlänge stimuliert werden. Somit können die durch stimulierte Emission abgeregten Moleküle kein spontanes Fluoreszenzlicht mehr aussenden, da sie ja nicht mehr im angeregten Zustand sind. In einem STED-Mikroskop wird das spontane Fluoreszenzlicht  von dem STED-Laser und der stimulierten Emission mittels eines Bandpassfilter getrennt.

Dieser Effekt alleine ergibt noch keine Verbesserung der räumlichen Auflösung. Dazu wird ein weitere Trick benötigt: Der die Moleküle abregende Laserstrahl (STED_Laser) wird zu einem ringförmigen Strahlprofil moduliert, der üblicherweise als „Donut“ bezeichnet wird. Durch die Überlagerung des STED und Anregungslasers im Mikroskop werden nur die Fluorophore im äußeren Ring abgeregt, womit Fluoreszenzlicht nur noch von einem sehr kleinen Punkt detektiert werden kann. Dieser kleinere Anregungsfokus ermöglicht das Erreichen von räumlichen Auflösungen, die jenseits der Beugungsgrenze liegen.

Abbildung 1. Die Kernkomponenten eines easySTED Systems, wie z.B. das MicroTime 200 STED von PicoQuant, sind der Anregungs- und STED-Laser, die in eine gemeinsame optische Faser eingekoppelt werden, eine λ/4 Platte, ein dichroischer Spiegel und eine Phasenplatte. Das emittierte Licht der Probe passiert den dichrosichen Spiegel und wird auf die Lochblende fokussiert, bevor es zum Detektor geführt wird. (Dichroische Spiegel haben eine kritische Wellenlänge: Licht mit kleineren Wellenlängen wird reflektiert, Licht mit größeren Wellenlängen durchgelassen. Der Spiegel wird so gewählt, dass die kritische
Wellenlänge zwischen Anregungs- und Emissionsmaximum liegt.)

Um eine hohe Auflösung mit gutem Signal-zu-Rauschen-Verhältnis zu erhalten, müssen der Anregungsfokus und STED-Donut räumlich perfekt aufeinander ausgerichtet sein. Es gibt zwei Ansätze, um dies zu erzielen: Entweder wird der STED-Laserstrahl erst moduliert, damit sich ein Donut-Profil im Fokus ergibt und dann räumlich mit dem Anregungsstrahl überlagert, oder die beiden Laser werden erst kombiniert und anschließend so modifiziert, dass nur der STED-Laser die Donut-Form im Fokus erhält. Die letztere Methode ist inhärent einfacher zu implementieren, da beide Laserstrahlen aus einer gemeinsamen optischen Faser ausgekoppelt werden können, und wurde von Reuss und Engelhardt 2010 beschrieben.[10] Diese Implementierung wird wegen ihrer Einfachheit auch „easySTED“ genannt, und ihr Kernelement ist eine segmentierte Phasenplatte, d-e die Polarisation des STED-Lasers schrittweise ändert, was zu der Bildung der Ringform im Fokus führt (siehe Abbildung 1). Die Polarisation des Anregungslaser wird zwar auch von der Phasenplatte beeinflusst; jedoch ist er nach dem Durchgang wieder in Phase, womit der Anregungsstrahl sein gaussförmiges Profil behält.

Die Effizienz des STED-Prozesses und die somit erreichbare optische Auflösung hängt maßgeblich von den Eigenschaften des STED-Laser ab, wie dessen Leistung, Pulsbreite und  -wiederholungsfrequenz. Ein kürzlich von PicoQuant entwickelter 765 nm Laser wurde auf optimale STED-Effizienz ausgelegt. Er hat eine Pulsbreite von einigen Hundert Picosekunden, was sich als optimal erweist für höchstmögliche STED-Auflösung bei gleichzeitiger Minimierung der Photodegradation. Längere Laserpulse oder Dauerstrichbetrieb können die Probe einer unnötig erhöhten Lichtmenge aussetzen, die zur Beschädigung der Probe führen kann.[11]

Die Problematik des Photobleichens muss bei dieser Methode immer beachtet werden, da für die Deaktivierung der Fluorophoren eine relativ intensive STED-Laserleistung benötigt wird. Es wurden aber in den letzten Jahren fluoreszierende Label mit hoher Photostabilität und Kompatibilität mit biologischen Proben entwickelt. Diese Bibliothek an Molekülen wird kontinuierlich erweitert, wodurch der Anwendungsbereich von STED weiter expandiert wird.

Abbildung 2. Die mittels STED-Mikroskopie (rechts unten) aufgenommenen Bilder zeigen feine Strukturen und Details, die in den konfokalen Bildern der konventionellen Fluoreszenzmikroskopie (links oben) nicht aufgelöst sind. Dieses Beispiel zeigt die Tubulin-Struktur einer Vero-Zelle, die mit Abberior STAR 635p gelabelt wurden. (Vero-Zellen stammen aus einer etablierte Zelllinie, die aus normalen Nierenzellen von Grünen Meerkatzen (Chlorocebus) gewonnen wurde)

Das STED-Verfahren führt nicht nur im stationären Modus der Fluoreszenzmikroskopie zu einer Verbesserung der Auflösung (siehe Abbildung 2), sondern ist auch von Nutzen im zeitaufgelösten Bereich. Die zusätzlich zur räumlichen Information verfügbaren Fluoreszenzlebensdauern ermöglichen es, verschiedene Fluorophore, die in einem ähnlichen Spektralbereich emittieren, zu unterscheiden. Diese Methode ist als „pattern matching“ bekannt, wobei verschiedene Eigenschaften der Fluorophore, wie Anregungs- und Emissionswellenlänge sowie Lebensdauern, zu deren Unterscheidung herangezogen werden (siehe Abbildung 3).[12]

Abbildung 3. Zwei fluoreszierende Spezies können durch Pulsed Interleaved Excitation (PIE) mit leicht verschobenen Wellenlängen und zeitaufgelöster Detektion in zwei Spektralbändern unterschieden werden. Die Beiträge beider Fluorophoren wurden mittels „fluorescence pattern matching“ bestimmt. Das Beispiel zeigt Tubulin, das mit Abberior STAR 635p (grün), und Giantin, das mit ATTO647N (rot), markiert wurde unter Verwendung einer einzigen STED-Laserwellenlänge und Anregung bei 634 nm und 660 nm. Probe mit freundlicher Genehmigung von Markus Sauer, Universität Würzburg.

Die STED-Mikroskopie ist für sich genommen schon sehr leistungsstark, da die verbesserte räumliche Auflösung zusätzliche strukturelle Informationen bietet. Im Zusammenspiel mit zeitaufgelösten Messmethoden können noch mehr Eigenschaften erfasst werden, wie z.B. die Konzentration oder chemische Umgebung der Fluorophore durch deren Lebensdauern oder deren Diffusionsgeschwindigkeit mittels Fluoreszenzkorrelationsspektroskopie. In einem flexiblen, modularen Mikroskopdesign kann STED auch mit Methoden wie Rasterkraftmikroskopie oder Fluoreszenzspektroskopie kombiniert werden.

Literatur

[1] Abbe, E. (1873). Beiträge zur Theorie des Mikroskops und der mikroskopischen Wahrnehmung. Archiv für mikroskopische Anatomie, 9(1), 413-418.

[2] Heinzelmann H, Pohl D.W., “Scanning near-field optical microscopy”, Appl.Phys A, Vol. 59(2), p 89-101 (1994)

[3] A. Harootunian et al. (1986). Superresolution fluorescence near field scanning optical microscope. Appl Phys Lett, Vol. 49, p. 674.

[4] Betzig E., Patterson G. H., Sougrat R., Lindwasser W., Olenych S., Bonifacino J. S., Davidson M. W., Lippincott-Schwartz J., Hess H. F., “Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution”, Science, Vol.313, p.1642-1645 (2006)

[5] Bates M., Huang B., Zhuang X.,”Super-resolution microscopy by nanoscale localization of photo-switchable fluorescent probes”, Current Opinion in Chemical Biology, Vol.12, p.505-514 (2008)

[6] Gustafsson M. G. L., “Surpassing the lateral resolution limit by a factor of two using structured illumination microscopy: short communication”, Journal of Microscopy, Vol.198, p.082-087 (2000)

[7] M.G.L. Gustafsson (2000). “Surpassing the lateral resolution limit by a factor of two using structured illumination microscopy”. J Microsc, Vol. 198, pp. 82-87.

[8] Hell S.W., Wichmann J., “Breaking the diffraction resolution limit by stimulated emission: stimulated- emission- depletion fluorescence microscopy”, Optics Letters, Vol.019, p.780-782 (1994)

[9] S. Hell, Angewandte Chemie, “Nanoskopie mit fokussiertem Licht (Nobel-Aufsatz)
” 2015, 127, 8167–8181.

[10] Reuss M., Engelhardt J., Hell S. W., “Birefringent device converts a standard scanning microscope into a STED microscope that also maps molecular orientation”, Optics Express, Vol.018, p.01049-01058 (2010)

[11]  Leutenegger M., Eggeling C., Hell S.W. , “Analytical description of STED microscopy performance”. Optics Express, Vol. 18, p. 26417-26429 (2010)

[12] Gregor I., Krämer B., Koberling F., Erdmann R., Enderlein J., Wahl M., Fore S., “Fast algorithms for the analysis of spectral FLIM data”, Proceedings of SPIE, Vol.7903, 790330 (2011)