Analytik mit Chemilumineszenz – CSI, Blut und Ähnliches

Nach vielen hundert Fernsehfolgen von CSI: Miami, CSI: Vegas und von anderen kriminellen Hochburgen der USA sowie den vielen sonntäglichen Tatortfilmen, kann der durchschnittliche Krimizuschauer selbständig jeden noch so kleinen Blutfleck auf dem Badewannenrand auffinden, wenigstens theoretisch. Obwohl dem Beobachter der Begriff Chemilumineszenz wenig sagt, weiß er, dass man erst etwas sprühen und dann mit einer UV-Lampe beleuchten muss, um das schreckliche Geschehen der letzten Nacht sichtbar zu machen. Den ganz Klugen fällt dann natürlich auf, dass man kein Licht braucht, um diese Luminol-Chemilumineszenz zu beobachten. Somit sollte man an dieser Stelle auch die Frage stellen, was Lumineszenz eigentlich überhaupt ist.

Der Begriff der Lumineszenz beschreibt lediglich die Leuchterscheinung; was dieses Leuchten auslöst, geht daraus nicht hervor. Dass eine mögliche Energiequelle für Leuchtprozesse der elektrische Strom ist, entweder für thermisch ausgelöstes Leuchten (in Glühlampen), als Entladungsleuchten (in Energiesparlampen) oder als Elektrolumineszenz (in LED oder OLED), ist offensichtlich. Aber auch Leuchtprozesse, die durch Reiben (Tribo-), Ultraschall (Sono-), oder Radioaktivität (Radio-) ausgelöst werden, sind bekannt und im Alltag manchmal beobachtbar, z.B. das legendäre Leuchten (Tribolumineszenz) bei Aufreißen selbstklebender Briefumschläge oder beim Dehnen von Klebefolien. Bio- und Chemilumineszenz sind grundsätzlich identische Phänomene und die Unterscheidung manchmal irreführend. In beiden Fällen sind chemische Prozesse Ursache der Lumineszenz, im Falle biolumineszenter Organismen durch Enzyme katalysiert. Wer kennt nicht die faszinierende Biolumineszenz des Glühwürmchens bzw. von Leuchtkäfern, die je nach Art unterschiedliche Lichtsignale abgeben können. Der molekulare Mechanismus dieses Vorgangs ist sehr gut bekannt.[1]

Schema 1: Übliche Grundzustandsreaktion versus Chemilumineszenzprozess (A = Ausgangsver-bindung, P & P* = Produkt (* angeregt), B = Hochenergie-Zwischenstufe mit Beispielen).

Wie nun die bereits erwähnte Luminol-Chemilumineszenz funktioniert, ist erstaunlicher-weise immer noch nicht vollständig geklärt. Die Ingredienzien sind bekannt, ein Oxidationsmittel, eine Base, das Luminol selbst und ein Katalysator. Der Eisenporphyrinkomplex im Blut kann dieser Katalysator sein, aber auch andere Metallkomplexe. Was am Ende entsteht und für die Lumineszenz verantwortlich zeichnet, ist auch bekannt, man kann es isolieren und analysieren, das 4-Aminophthalat. Beleuchtet man dieses Endprodukt der Reaktion dann wirklich mit einer UV-Lampe (sieht die CSI-Szenen), dann fluoresziert dieses Produkt ähnlich wie die vorhergegangene Chemilumineszenz. Dieser Effekt ist dann aber eine typische Photolumineszenz. Zwischen Anfang und Ende sucht der Chemiker aber das Dazwischen, wichtig für das molekulare Verständnis und auch für mögliche Weiterentwicklungen und Verbesserungen. Sowohl bei chemilumineszenten als auch biolumineszenten Prozessen müssen Hochenergiezwischenstufen durchlaufen werden, deren Energieinhalt über bzw. nahe dem elektronisch angeregter Moleküle liegt. Da diese energiereichen Intermediate meist über Oxidationsprozesse gebildet werden, sind oft Sauerstoff, Wasserstoffperoxid oder Superoxid als Reagenzien involviert und führen zur Bildung von 1,2-Dioxetanen, 1,2-Dioxetanonen oder bicyclischen Endoperoxiden; letzteres auch bei der Aktivierung des Luminols postuliert.

Abb.1: Luminol-Chemilumineszenz, gut aufgehoben in den Händen einer Chemie-Doktorandin

Bei der ebenfalls gut bekannten Chemilumineszenz von light sticks wird ein 1,2-Dioxetandion gebildet, das sicherlich spektakulärste Intermediat aus zwei CO2-Einheiten. Der Zerfall dieser Verbindung führt zu einem elektronisch angeregten Kohlendioxid, welches wiederum Energie auf verschiedene fluoreszierende Farbstoffmoleküle übertragen kann, daher auch die Farbenvielfalt dieser Chemilumineszenzstäbchen. Dies zeigt die zwei möglichen Quellen des Leuchtens auf: (a) der chemilumineszierende Stoff resultiert aus dem thermischen Zerfall der oxidativ gebildeten Zwischenstufe oder (b) der chemilumineszierende Stoff erhält seine Anregungsenergie durch Energietransfer aus einem primären Anregungszustand. Neben den thermisch induzierten Zerfallsreaktionen existiert auch der durch Elektronentransfer ausgelöste Zerfallsprozess CIEEL, die chemically initiated electron exchange luminescence, bei der ein Reduktionsmittel den Zerfall der Hochenergie-zwischenstufe auslöst.


Die Natur hält ebenfalls eine Vielzahl an potentiell chemilumineszenten Substanzen bereit, den sogenannten Luciferinen (den „Lichtträgern“). Diese Verbindungen umfassen ein erstaunlich breites Spektrum an organischen Strukturen, denen gemeinsam ist, dass sie unter oxidativer Aktivierung Hochenergiezwischenstufen bilden, meistens die bereits erwähnten Dioxetanone oder 1,2-Dioxetane. Damit diese Prozesse unter den milden physiologischen Bedingungen ablaufen können, sind entsprechende Enzyme, Luciferasen, vonnöten.[2] Lucerferine werden in Kombination mit geeigneten Luciferasen zu extrem empfindlichen Nachweisreagenzien in bioanalytischen Verfahren, z.B. Western-blots, eingesetzt. Diese Verfahren erlauben den Nachweis von Analyten, z.B. ATP, bis in den Subattomolbereich, d.h bis zu zeptomolaren Größenordnungen (1 zmol = 10-21 Mol). In molekularbiologischen Verfahren kann man auf diese Weise Genexpression über die für die Luciferasen verantwortlichen Gene, die als Reportergene eingesetzt werden, direkt sichtbar machen.

Schema 2: Die strukturelle Vielfalt einiger synthetischer und natürlicher Luciferine.

Die grün-blaue Emission beim Zerfall der neu entwickelten Benzofuranone ist ein Beispiel für die spannenden molekularen Prozesse, die mit dem Phänomen der Chemilumineszenz verbunden sind.[3] Wie an dem Vorläufermolekül in Abbildung 2 gezeigt, verändert sich die Emissionswellenlänge während des zunehmenden Umsatzes an Ausgangsverbindung immer weiter in den blauen Bereich.[4] Die Photolumineszenz der am Ende gebildeten Stoffe ist hingegen im Vergleich zur Chemilumineszenz zumeist rotverschoben,[3] beides noch wenig verstandene Phänomene.

Abb.2: Chemilumineszenz eines Benzofuranons nach Zugabe einer Base (DBU).[4]

Ob die Synthesechemie überhaupt noch etwas zu diesem so intensiv untersuchten Forschungsgebiet beitragen kann? Wenn man sich nun auf den einfachen Standpunkt einer Hochenergiezwischenstufe stellt und den Übergang in einem elektronischen Zustand berechnet, so bewirken kleine strukturelle Veränderungen der Ausgangsstoffe starke Veränderungen der Übergangswahrscheinlichkeiten. Dies wurde am Beispiel dialkylierter Luminole eindrucksvoll nachgewiesen.[5] Somit bleiben für den Synthesechemiker noch viele Herausforderungen sowohl bei der Optimierung bekannter als auch bei Realisierung neuer Stoffe, die für empfindliche analytische Zwecke eingesetzt werden können oder auch nur für chemische Weihnachtsvorlesungen.

Abb.3: Verstärkung der Luminol-Chemilumineszenz durch Kernsubstitution.[5]

Literatur

[1] H. Fraga, Firefly luminescence: a historical perspective and recent developments. Photochem. Photobiol. Sci. 2008, 7, 146–158.

[2] T. Wilson, J. W. Hastings, Bioluminescence: Living lights, lights for living, Harvard University Press, 2013. 

[3] L. F. M. L. Ciscato, F. H. Bartoloni, A. S. Colavite, D. Weiss, R. Beckert, S. Schramm, Evidence supporting a 1,2-dioxetanone as an intermediate in the benzofuran-2(3H)-one chemiluminescence, Photochem. Photobiol. Sci. 2014, 13, 32-37.

[4] A. G. Griesbeck, S. Dick, M. Renner, unpublizierte Ergebnisse.

[5] A. G. Griesbeck, Y. Díaz-Miara, R. Fichtler, A. Jacobi von Wangelin, R. Pérez-Ruiz, D. Sampredo, Steric enhancement of the chemiluminescence of luminols, Chem. Eur. J. 2015, 21, DOI: 10.1002/chem.201500798