Entwicklung von Nanofähren zur gezielten Krebsbekämpfung mit Hilfe superhochauflösender Lichtmikroskopie

Dass der Mensch ein Interesse daran hat, das quasi Unsichtbare sichtbar zu machen, zeigt sich nicht nur in Filmen wie „Die phantastische Reise“ oder „Die Reise ins Ich“. Auch in der Wissenschaft offenbart sich dieser Drang. Da das Auge aber relativ schnell an seine Grenzen stößt, wurde die Lichtmikroskopie mit erhöhtem Auflösungsvermögen entwickelt (s. Abb. 1). Sie erlaubt, tiefer in die Dinge hinein zu schauen. Es war Robert Hooke, der 1667 mit seinem Lichtmikroskop die ersten Zellen sehen konnte und kurz danach entdeckte Antoni van Leeuwenhoek auf dieselbe Weise Bakterien im menschlichen Speichel. Zellen sind mit einer Größe von ca. 20 μm für die Beobachtung mit konventioneller Lichtmikroskopie noch relativ groß. Möchte man allerdings einzelne Bausteine der Zelle sehen wie z.B. Mitochondrien oder gar Proteine, so reicht das Auflösungsvermögen normaler Lichtmikroskope dazu nicht mehr aus.

Als erster konnte Ernst Abbé - vor ca. 150 Jahren Direktor bei Zeiss und für die Mikroskopentwicklung zuständig - die physikalisch bedingte Auflösungsgrenze von Mikroskopen berechnen. Seine Formeln ergaben, dass durch die Beugungsbegrenzung nur Objekte aufgelöst werden können, deren Größe die der halben Wellenlänge des verwendeten Lichts übertreffen (d.h. Δx ≥ λ/2). Diese Formel ist nicht nur für sichtbares Licht gültig, sondern trifft generell für elektromagnetische Strahlung zu und ist damit auch für beschleunigte Elektronen in der Elektronenmikroskopie gültig. Wird die kürzeste Wellenlänge des sichtbaren Spektrums (400-800 nm) verwendet, d.h. blaues Licht (400 nm), können nach dem Abbé-Limit mit der Lichtmikroskopie noch Objekte bis zu einer Größe von 200 nm aufgelöst und einzeln sichtbar gemacht werden. Die Elektronenmikroskopie schafft aufgrund der kürzeren Wellenlängen, abhängig von der Beschleunigungsspannung, entsprechend höhere Auflösungen.

Abbildung 1: Größenvergleich biologisch relevanter Strukturen mit Einordnung in die verschiedenen Mikroskopietechniken.

Die Lichtmikroskopie hat aber gegenüber der Elektronenmikroskopie den großen Vorteil, dass direkt lebende Zellen beobachtet werden können und die Objekte nicht fixiert (tote Zellen) und durch feine Präparationsschnitte aufwändig aufbereitet werden müssen. Deshalb war es ein großer Schritt nach vorne, als es möglich wurde, mit optischen Techniken das Abbé-Limit zu umgehen und zu einer superhochauflösenden Lichtmikroskopie vorzudringen. Diese ist vor allen Dingen für Fragen der molekularen Medizin von großer Bedeutung, wurde es damit doch möglich, z.B. die Aggregation von Proteinen im Verlauf von Krankheiten wie Alzheimer, Parkinson oder Chorea Huntington aufzulösen und in der Zelle zu verfolgen. Für Techniken, die dies ermöglichen, wurde 2014 der Chemie-Nobelpreis an Eric Betzig, Stefan Hell und William E. Moerner vergeben. Die Entwicklung dieser Methoden hat mit der Detektion einzelner Moleküle (kleiner als 1 nm) vor 25 Jahren begonnen. Zwar ist der Abbildungsfleck („point spread function“) eines einzelnen fluoreszierenden Moleküls durch das Abbésche Beugungslimit begrenzt und mit 200 nm viel größer als das Molekül selbst. Aber durch die Bestimmung des Intensitätsmaximums im Beugungsfleck (d.h. der Position des Intensitätspeaks) kann das Molekül hochgenau bis auf wenige nm lokalisiert werden. Man nennt dies auch „Superlokalisation“ eines einzelnen Moleküls. Durch diese Umgehung des Beugungslimits ist die Auflösung in Form von Lokalisierung von einzelnen fluoreszierenden Molekülen quasi um den Faktor 100 verbessert worden. (Weitere Techniken zur Superhochauflösung wie PALM, STORM und STED werden im Artikel „Superhochauflösende Mikroskopie: Nobelpreis in Chemie 2014 für Eric Betzig, Stefan Hell und William E. Moerner“ im Einzelnen genauer dargestellt. [1])

In unserem Labor wurde Superhochauflösung durch Einzelmolekülverfolgung erstmals verwandt, um den Infektionsweg eines einzelnen Virus in eine lebende Zelle hinein detailliert zu verfolgen. [2] Dazu wurde das Virus mit einem Fluoreszenzmolekül markiert, welches wie eine molekulare Lampe die Bewegung des Virus sichtbar gemacht hat. So konnte der Infektionsweg eines einzelnen Virus quasi als Film in Echtzeit aufgenommen werden und alle Stationen, vom Andocken des Virus an die Zelle über den Zelleintritt sowie die verschiedenen Transportmechanismen innerhalb der Zelle bis zur Ankunft des Virus im Zellkern, im Detail verfolgt werden. Dieses Resultat hat damals für großes Aufsehen gesorgt und wurde u.a. in der Tagesschau des Deutschen Fernsehens gezeigt.

Heute beobachten wir mit unseren selbst gebauten hoch- und superhochauflösenden Lichtmikroskopen in analoger Weise auch andere Nanoteilchen in ihrer Wechselwirkung mit lebenden Zellen (Viren sind mit ihren Dimensionen von 10-300 nm auch typische Nanoteilchen). [3-5] Dabei sind für uns vor allen Dingen synthetische Nanoteilchen von großem Interesse, die in ihrem Inneren mit Medikamenten beladen werden und die diese Medikamente im Körper eines Patienten gezielt in erkranktes Gewebe bzw. kranke Zellen hinein transportieren können. Es ist sofort evident, dass Nanoteilchen, die in dieser Weise als quasi intelligente Nanofähren den gezielten Transport von Medikamenten erlauben, für die Medizin von enormem Nutzen sein können und ein großes Potential darstellen. Insbesondere wird in der Krebstherapie angestrebt, diesen Ansatz zum Erfolg zu bringen. [6] So versucht man in der Chemotherapie, die hochtoxischen Chemotherapeutika in solche Nanopartikel zu verpacken, welche dann den Wirkstoff gezielt in Krebszellen transportieren. Erst dort wird das Nanopartikel geöffnet, sodass das hochtoxische Chemotherapeutikum die Krebszellen abtöten kann. Während des Transportes hingegen bleibt das Chemotherapeutikum durch die Verpackung unschädlich. Gegenüber heutiger Chemotherapie, bei der man nicht weiß, ob der Patient letztlich an Krebs oder an den Nebenwirkungen des hochtoxischen Chemotherapeutikums stirbt, sollte diese Therapie eine weitgehend nebenwirkungsfreie und damit ungefährliche Behandlungsmethode darstellen.

Hierfür haben wir in einem Team (Prof. Christoph Bräuchle gemeinsam mit Prof. Thomas Bein, beide LMU München) eine hochflexible Plattform von Nanoteilchen geschaffen, bei denen der Wirkstoff in die Poren von mesoporösen Nanoteilchen aus SiO2 eingelagert wird und die Teilchen anschließend mit einer Doppellipidmembran umhüllt und verschlossen werden (s. Abb. 2). [7] SiO2 Nanoteilchen werden nach heutigem Stand der Technik gefahrlos im Körper abgebaut. Die umhüllende Doppellipidmembran ist der Zellmembran sehr ähnlich und deshalb ebenfalls gut bioverträglich. In der umhüllenden Doppellipidmembran sind Liganden verankert, die an Rezeptoren andocken können, die speziell auf Krebszellen zu finden sind. Damit wird erreicht, dass sich die Teilchen mit großer Sicherheit nur an Krebszellen anheften (Targeting) und anschließend von diesen durch den Biologen gut bekannten rezeptorvermittelnden Endozytosemechanismus aufgenommen werden. Im Inneren der Krebszelle müssen die Nanoteilchen dann geöffnet werden, was in diesem Fall wieder durch Licht geschieht. Hierbei werden Photosensibilisatoren, die an das SiO2-Nanoteilchen angeheftet wurden, durch rotes Licht oder nahes Infrarotlicht (Licht dieser Wellenlängen kann tiefer in das Gewebe eindringen [8]) aktiviert, wodurch Singulett-Sauerstoff entsteht, der hochreaktiv die Doppellipidmembranhülle öffnet (inkl. des Endosoms, in dem sich das Partikel nach der Endozytose befindet). Damit kann der Wirkstoff (Chemotherapeutikum) in das Zellinnere austreten und die Krebszelle abtöten. Wir haben außer mit externer Photoaktivierung auch Nanoteilchen konstruiert, die mit einem zellinternen Trigger wie der pH-Änderung im Endosom die Öffnung der Nanoteilchen vornehmen. [9] Dem o.a. Forscherteam ist es damit gelungen, viele erforderliche Funktionen in den Nanopartikeln zu vereinen.

Abbildung 2: Schematische Darstellung eines Nanopartikels aus mesoporösem Siliziumdioxid mit unterschiedlichen Funktionalisierungen. Das Partikel ist beladen mit einem Modelmedikament, die Hülle wird durch eine Doppellipidschicht gebildet, in welche unterschiedliche Liganden (Folat oder Epidermaler Wachstumsfaktor/EGF) verankert sind. Die Umhüllung wird durch Belichten des Photosensibilisators geöffnet. [7]

Mit unseren hoch- und superhochauflösenden Mikroskopietechniken konnten wir die korrekte Funktion dieser Nanoteilchen an einzelnen Krebszellen im Detail nachweisen. So ist es uns z.B. möglich, die Aufnahme dieser Nanoteilchen über angeheftete fluoreszierende Farbstoffe im Detail zu verfolgen. Abb. 3 zeigt die aufgezeichnete Spur eines Nanoteilchens, wie sich dieses an die Zelle mittels Ligand-Rezeptor-Wechselwirkung anheftet und damit zuerst auf der Zelloberfläche transportiert wird (gelb unterlegter Teil), dann durch die Zellmembran hindurchdringt und sich im Zytosol der Zelle in freier Diffusion bewegt (grün unterlegter Teil), bis es sich an ein Motorprotein der Zelle anheftet und mit diesem als zelleigenem Transportmechanismus rasch ins Innere der Zelle transportiert wird (rot unterlegter Teil).

<br />Abbildung 3: Abgebildet ist eine Leberkrebszelle die mit Nanoteilchen inkubiert wurde. Die Nanoteilchen sind mit Liganden für Rezeptoren an Leberkrebszellen ausgestattet und docken dort spezifisch an. Rechts ist die Spur, die ein Nanoteilchen in etwa sechs Minuten zurücklegt, in Superhochauflösung gezeigt. Hat das Nanoteilchen an der Zelloberfläche angedockt, surft es mit dem Rezeptor auf der Zelloberfläche (gelb hinterlegter Teil der Trajektorie), dann tritt es durch die Membran in das Innere der Zelle und diffundiert im Zytosol der Zelle, wie an der unregelmäßigen Diffusionsspur (grün hinterlegt) sichtbar wird. Während dieser Diffusion trifft das Nanoteilchen auf ein Motorprotein und wird von diesem quasi als „Hitchhiker“ rasch in das Innere der Zelle transportiert, erkennbar an der zielgerichtete Transportspur (rot unterlegter Teil). [5]

In Abb. 4 zeigen wir die Öffnung solcher Nanoteilchen, die bereits in die Zelle aufgenommen worden sind. Dabei sieht man, dass nach dem roten Lichtblitz die Photosensibilisatoren aktiviert und damit die Hülle um die aufgenommenen Teilchen aufgesprengt wird, wodurch das grün fluoreszierende Modellmedikament Calcein aus den Teilchen freigesetzt wird und in das Zytosol hineinströmt. Im echten Einsatz wird dann Calcein z.B. durch Doxorubicin als hochtoxisches Chemotherapeutikum ersetzt. Mit derartigen, sehr detaillierten lichtmikroskopischen Untersuchungen, die in Echtzeit an lebenden Zellen durchgeführt werden, können die o.a. beschriebenen Nanoteilchen konsequent als Nanofähren für den gezielten Transport von Medikamenten entwickelt und getestet werden. Die Bildsequenzen und Filme, die wir hier über das Verhalten unserer Nanoteilchen in der lebenden Zelle und später im Gewebe aufzeichnen können, zeigen uns nicht nur die Funktion unserer Nanoteilchen, sondern auch Engpässe, die eventuell noch vorhanden sind und die mit erweiterten Designansätzen für die Konstruktion der Nanopartikel beseitigt werden können. Auf diese Weise lassen sich Nanopartikel als quasi intelligente Nanofähren konsequent optimieren bis zum Einsatz in Tiermodellen und am Menschen. Derzeit arbeiten wir bereits mit solchen Nanoteilchen in Mäusen.

Abbildung 4: Freisetzung eines Modellmedikamentes im Inneren der Zelle. Konventionelle Fluoreszenzmikroskopie von Nanoteilchen, die mit einem Modellmedikament (Calcein, grün) beladen wurden und an die ein Photosensibilisator (rot) angebracht wurde. Die Nanoteilchen wurden vor der Aufnahme auf die Zellen gegeben. Die linke Spalte zeigt die Verteilung der Nanoteilchen in der Zelle vor der Lichtaktivierung des Photosensibilisators. In den folgenden drei Spalten ist die Freisetzung des Modelmedikamentes (Ausströmen des grün fluoreszierenden Calceins in die Zelle hinein) über 10 min. nach der Lichtaktivierung zu sehen. Die Maßstabsleiste beträgt 10 ?m. Die untere Reihe von Bildern stellt die Konzentration (Intensität) der Farbstoffe entlang der Querschnitte dar. Im Fall des Modellmedikaments änderst sich diese Verteilung von punktueller (vor der Freisetzung) zu einer flächigen Verteilung (Calcein konnte nach Freisetzung ausströmen). [7]

Besonders interessant an unserem Ansatz ist unter anderem, dass mit der Plattform an Nanoteilchen, die wir bisher entwickelt haben, sehr leicht einerseits die Liganden (d.h. die Zielzellen, in denen das Medikament ankommen soll) als auch die Beladung (d.h. die Art des Medikamentes) geändert werden können. Damit ist im Prinzip gezeigt, dass sich so eine relativ breite Basis für Medikamententransport („Targeted Drug Delivery with Nanoparticles“) aufbauen lässt, die zur Behandlung von vielerlei Krankheiten eingesetzt werden könnte. Für die Krebstherapie eröffnet sich hier prinzipiell die Möglichkeit einer personalisierten Medizin. In einer solchen Medizin wird das Ligandenspektrum auf das spezielle Spektrum der Rezeptoren der Krebszellen eines einzelnen Patienten abgestimmt und das Chemotherapeutikum der entsprechenden Krebsart, die bekämpft werden soll, optimal angeglichen. Diese Strategie, die speziell auf den einzelnen Patienten zugeschnitten ist, ist eines der Ziele, die in einer modernen Krebstherapie angestrebt werden. Wir hoffen, mit unserer Forschung einen wichtigen Beitrag zur Krebstherapie leisten zu können.

Literatur

[1]   Möckl, L., Lamb, D.C., Bräuchle, C., Superhochauflösende Mikroskopie: Nobelpreis in Chemie 2014 für Eric Betzig, Stefan Hell und William E. Moerner. Angewandte Chemie, 2014. 126(51): p. 14192-14197.


[2]    Seisenberger, G., Ried, M. U., Endreß, T., Büning, H., Hallek, M., Bräuchle, C., Real-Time Single-Molecule Imaging of the Infection Pathway of an Adeno-Associated Virus. Science, 2001. 294(5548): p. 1929-1932.


[3]    Baumgartel, V., Ivanchenko, S., Dupont, A., Sergeev, M., Wiseman, P. W., Krausslich, H.-G., Bräuchle, C., Muller, B., Lamb, D. C., Live-cell visualization of dynamics of HIV budding site interactions with an ESCRT component. Nat Cell Biol, 2011. 13(4): p. 469-474.


[4]   Torrano, A.A., Bräuchle C., Precise quantification of silica and ceria nanoparticle uptake revealed by 3D fluorescence microscopy. Beilstein Journal of Nanotechnology, 2014. 5: p. 1616-1624.


[5]    Ruthardt, N., Lamb, D.C.,  Brauchle, C., Single-particle Tracking as a Quantitative Microscopybased Approach to Unravel Cell Entry Mechanisms of Viruses and Pharmaceutical Nanoparticles. Mol Ther, 2011. 19(7): p. 1199-1211.


[6]   Argyo, C., Weiss, V., Bräuchle, C., Bein, T., Multifunctional Mesoporous Silica Nanoparticles as a Universal Platform for Drug Delivery. Chemistry of Materials, 2014. 26(1): p. 435-451.


[7]    Mackowiak, S. A., Schmidt, A., Weiss, V., Argyo, C., von Schirnding, C., Bein, T., Bräuchle, C., Targeted Drug Delivery in Cancer Cells with Red-Light Photoactivated Mesoporous Silica Nanoparticles. Nano Letters, 2013. 13(6): p. 2576-2583.


[8]    Anderson, R.R., Parrish J.A., The optics of human skin. Journal of Investigative Dermatology, 1981. 77(1): p. 13-19.


[9]    Niedermayer, S., Weiss V., Herrmann A., Schmidt A., Datz S., Müller K., Wagner E., Bein T., Bräuchle C., Multifunctional Polymer-Capped Mesoporous Silica Nanoparticles for pH-Responsive Targeted Drug Delivery. Nanoscale, DOI: 10.1039/c4nr07245f (2015).