| Abbildung 1: Prinzip der SPR-Messtechnik |
„Mit Biosensoren Antibiotikarückstände in Lebensmitteln entdecken“ |
Michael Petz und Giuseppe Cacciatore
Wenn Masttiere, Fische aus Aquakulturen, Milchvieh, Legehennen oder Honigbienen mit Antibiotika behandelt werden, dann muss mit Rückständen dieser Antibiotika in Fleisch, Milch, Eiern oder Honig gerechnet werden. Die an der Handelskette Beteiligten sind im Rahmen ihrer Sorgfaltspflicht verantwortlich, dass nur zugelassene Antibiotika eingesetzt werden und die vorgeschriebene Wartezeit zwischen Medikation und Schlachtung bzw. Vermarktung eingehalten wird, damit die zulässigen Höchstmengen für die Rückstände nicht überschritten werden. Die Sorgfaltspflicht wird flankiert durch amtliche Kontrollen, die in den Mitgliedsstaaten der Europäischen Union nach einheitlicher Vorgehensweise erfolgen muss. Auf nationaler Ebene ist dies im Nationalen Rückstandskontrollplan (NRKP) umgesetzt, dessen Koordination in der Verantwortung des Bundesamtes für Verbraucherschutz und Lebensmittelsicherheit (BVL) liegt. Diese Behörde veröffentlicht auf ihren Internetseiten (www.bvl.bund.de) die Resultate zum NRKP und anderen Kontrollmaßnahmen der amtlichen Lebensmittelüberwachung.
Mit der SPR-Sensoranalytik, die im folgenden erläutert wird, erweitert sich das Verfahrensspektrum zur Rückstandsanalytik auf Antibiotika um eine schelle, wenig arbeits- und wenig kostenaufwändige Methodik. In vielen Fällen ist es ausreichend, Milch und Honig zu verdünnen bzw. einen wässrigen Extrakt von anderen Lebensmitteln in das SPR-System zu injizieren. Je nach verwendetem Antikörper oder Rezeptorprotein lassen sich unterschiedliche Antibiotika nachweisen, z.B. Penicilline, Tetracycline, Aminoglycoside, Fluorochinolone, Sulfonamide oder Chloramphenicol. Da die gängigen SPR-Geräte mehrere Kanäle aufweisen, kann man einen Extrakt parallel auf mehrere Antibiotika untersuchen.
Sensoren sind Messfühler, wobei die pH-Elektrode der bekannteste (Chemo) Sensor in der chemischen Analytik ist. Die Messung der Wasserstoffionenkonzentration erfolgt durch Umwandlung einer chemischen Größe in ein elektrisches Messsignal. Bei einem Biosensor wird die zu analysierende Substanz (Analyt) durch einen biomolekularen Bindungspartner erkannt, z.B. durch Antikörper, Rezeptorproteine, Enzyme, Nucleotide oder auch komplette pflanzliche, tierische und bakterielle Zellen. Wenn der biomolekulare Bindungspartner den Analyten gebunden hat, muss dieses "biologische Signal" in ein elektrisches Signal umgewandelt werden. Dazu bedarf es eines Messwandlers (Transducer). Für bioanalytische Fragestellungen kommen elektrochemische, thermische, akustische und im Falle von "optischen Biosensoren" optische Transducer zum Einsatz. Für optische Biosensoren hat sich vor allem die Oberflächenplasmonresonanzspektrometrie (engl.: surface plasmon resonance, SPR) durchgesetzt.
Grundlagen der SPR-AnalytikDas Herzstück eines SPR-Gerätes ist ein kleiner, ca. 10 x 10 mm großer Biochip aus Glas, dem eine 50 nm dicke Goldschicht aufgedampft ist. Auf dieser Goldschicht befindet sich in der Regel eine Zwischenschicht aus Carboxymethyldextran, über dessen Carboxylfunktionen in Abhängigkeit vom Analysenprinzip entweder die biomolekularen Bindungspartner immobilisiert sind oder der Analyt bzw. ein geeignetes Derivat des Analyten. Der Biochip ist im SPR-Gerät dann so angeordnet, dass er mit der Glasschicht an ein Prisma angrenzt und mit der belegten Goldschicht an die zu analysierende Flüssigkeit (Abbildung 1).
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Werden die Leitungselektronen um die Atome des Metallgitters im Gold zu gekoppelten Schwingungen angeregt, dann bezeichnet man diese Schwingungen als "Oberflächenplasmonen". Sie lassen sich bei dünnen, nur wenige Nanometer dicken Metallfilmen dann anregen, wenn p polarisierte monochromatische Strahlung in einem bestimmten Resonanzwinkel auftrifft. Dieser Winkel ist größer als der Grenzwinkel der Totalreflexion und wird durch den Brechungsindex der angrenzenden Probelösung beeinflusst. Da die Oberflächenplasmonen durch Resonanz angeregt werden, d.h. Energie und Impuls der Photonen werden auf die Elektronen übertragen, verringert sich bei diesem Resonanzwinkel die Intensität des reflektierten Lichtes. Kommt es an der Oberfläche des Biochips zu Bindungsreaktionen, z.B. zwischen am Carboxymethyldextran immobilisierten Analyt und einem Antikörper, und damit zu einer Änderung der effektiven Oberflächenschichtdicke, ändert sich der Brechungsindex an der Oberfläche und damit der Resonanzwinkel. Die Veränderung dieses Winkels in Abhängigkeit von der Zusammensetzung der Messlösung ist die relevante Messgröße (response) in der SPR Analytik. Sie wird üblicherweise in "resonance units - RU" ausgedrückt, wobei eine RU einer Winkeländerung von ca. 0,00001° entspricht und durch eine Konzentrationsänderung auf der Biochipoberfläche von ca. 1 pg Protein je mm2 erreicht wird.
Analysengerät und Vorgehensweise bei der RückstandsanalytikDen prinzipiellen Aufbau eines SPR-Gerätes mit einer Durchflusszelle zeigt die Abbildung 2. Laufpuffer und Reagenzien werden über Spritzenpumpen zur Detektionseinheit transportiert. Die Reagenzien werden über einen Autosampler in das System injiziert und über Kapillarschläuche mit dem Laufpuffer zum Biochip, an welchem die eigentliche Analyse abläuft, transportiert.
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Die am Biochip ablaufenden Vorgänge lassen sich in Echtzeit verfolgen. Dies wird am Beispiel der Analyse von Chloramphenicol mit einem Chloramphenicol-spezifischen Antikörper deutlich (Abbildung 3). Zum Zeitpunkt t1 (Punkt A) beginnt mit der Injektion der Antikörper-haltigen Lösung die Bindung der Antikörper an das immobilisierte Chloramphenicol. Dies führt zu einer Erhöhung des Detektorsignals (Resonanzwinkeländerung ausgedrückt in RU) bis zum Zeitpunkt, zu dem der Wechsel auf reinen Laufpuffer erfolgt (Punkt B). Ab diesem Zeitpunkt kann das Ausmaß einer Dissoziation der Antigen Antikörper Komplexe beobachtet werden. Die Differenz der RU-Werte zu den Zeitpunkten t2 und t1 ist quantitativ korreliert mit der Menge der am Chip gebundenen Antikörper. Mittels einer Regenerierungslösung werden die gebildeten Antigen Antikörper Komplexe dissoziiert und der Biochip wird wieder in den Ausgangszustand überführt. Der Biochip kann daher kontinuierlich für weitere Analysen verwendet werden. Der gesamte Kurvenverlauf wird als Sensorgramm bezeichnet.
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Die Größe des Detektorsignals ist über einen großen Konzentrationsbereich proportional der am Chip gebundenen Masse. Hochmolekulare Verbindungen wie Proteine liefern eine große Signaldifferenz zwischen unbeladenem und beladenem Chip. Niedermolekulare Verbindungen wie Vitamine, Mykotoxine oder Rückstände von Pestiziden und Tierarzneimitteln liefern dagegen nur schwache Signale, wenn im Vergleich zu Proteinen äquimolare Mengen gebunden werden. Für die empfindliche Analytik niedermolekularer Verbindungen wird deshalb üblicherweise ein indirektes, kompetitives Assayformat genutzt, bei dem die betreffende niedermolekulare Verbindung in geeigneter Form am Biochip immobilisiert wird und der biomolekulare Bindungspartner, i.a. ein Antikörper, der Messlösung zugegeben wird. Im Fall von Milchproben, die auf Chloramphenicolrückstände untersucht werden sollen, würden die Proben mit Chloramphenicol-spezifischen Antikörpern versetzt und per Biosensor analysiert. Bei Milchproben, die kein Chloramphenicol enthalten, binden die Antikörper an die am Biochip immobilisierten Chloramphenicol-Moleküle und es kommt zu einem maximalen Detektorsignal. Bei Milch mit Chloramphenicolrückständen binden diese an die zugegebenen Antikörper, deren Bindestellen dann anteilig oder vollständig blockiert sind und nicht mehr für die Bindung an das am Biochip immobilisierte Chloramphenicol zur Verfügung stehen. Das Detektorsignal fällt entsprechend kleiner aus als bei der rückstandsfreien Milch und ist umgekehrt proportional zur Rückstandskonzentration an Chloramphenicol.
Werden hochspezifische Antikörper genutzt, dann lassen sich auch quantitative Daten erhalten. Rekombinant gewonnene, bakterielle Rezeptorproteine, wie sie in der SPR-Analytik beispielsweise für Penicilline, Cephalosporine oder Tetracycline eingesetzt werden, haben den Vorteil, alle Mitglieder der jeweiligen Antibiotikafamilie zu erfassen. Damit gelingt es, diejenigen Proben auszusortieren (Screening), die Rückstände aus einer bestimmten Antibiotikafamilie enthalten, bevor dann eine eindeutige Identifizierung und quantitative Bestimmung des als Rückstand vorliegenden Wirkstoffs mit aufwändigen massenspektrometrischen Verfahren erfolgt. Dies ist erforderlich, da z.T. für die einzelnen Antibiotika innerhalb einer Familie unterschiedliche Rückstandshöchstmengen bestehen. Die überwiegende Zahl der in der amtlichen Überwachung anfallenden Proben enthält keine Rückstände. Deshalb ist es wichtig, kostengünstige Screening-Verfahren der aufwändigen Identifizierung und quantitativen Bestimmung vorzuschalten.
| Schlauer Fuchs |
Unser Schlauer Fuchs diese Woche ist Alexandra H. aus Geesthacht. Zur Frage: Was versteht man unter Oberflächenplasmonen? Schickte sie uns die erste richtige Antwort. |
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