Walter Vetter, Natalie Rosenfelder, Simon Gaul, Joachim Melcher und Josef Hiebl

Die Untersuchung von Fisch und anderen marinen Lebensmitteln auf Rückstände polyhalogenierter Schadstoffe ist eine wichtige Aufgabe der Lebensmittelüberwachung. Diese langlebigen Verbindungen, die ehemals im Pflanzenschutz eingesetzt wurden oder als Flammschutzmitteln in Autos, elektronischen Geräten und Wohnungsreinrichtungsgegenständen Anwendung finden, wurden unbeabsichtigt in die Umwelt und damit auch in die Meere ausgetragen. Aufgrund ihrer Fettlöslichkeit werden die polyhalogenierten Schadstoffe dann von den Meerestieren aufgenommen und in der Nahrungskette angereichert. Über die aus dem Meer gewonnenen Lebensmittel gelangen sie somit wieder zum Verbraucher zurück. Die Untersuchung mariner Lebensmittel auf Polyhalogenverbindungen soll gewährleisten, dass Grenzwerte eingehalten werden. Hierbei wurden in den vergangenen Jahren mehrere bis dahin unbekannte Verbindungen in teilweise sehr hohen Konzentrationen detektiert. Unsere nachfolgenden Analysen belegten, dass es sich dabei um natürlich gebildete Verbindungen handelt, die sich strukturell kaum von den vom Menschen hergestellten Schadstoffen unterscheiden. Dabei legen unsere weitergehenden Analysen nahe, dass das Problem der Belastung mit halogenierten Naturstoffen verstärkt bei Fischen aus Aquakulturen auftritt und dass auch gängige Verfahren zur industriellen Entfernung von polyhalogenierten Verbindungen aus Fischölen bei vielen halogenierten Naturstoffen nur teilweise greifen.

Zu den schwerflüchtigen polyhalogenierten Verbindungen zählt eine Vielzahl von synthetisch hergestellten Stoffen, die sowohl im Pflanzenschutz (etwa DDT und Lindan) als auch für industrielle Anwendungen (z.B. PCB und polybromierte Flammschutzmittel) seit den 1940er Jahren im Millionen-Tonnen-Maßstab eingesetzt wurden. Aufgrund ihrer typischen Stoffeigenschaften Fettlöslichkeit und Langlebigkeit gepaart mit unerwünschten schädlichen Wirkungen wurden diese Stoffe allerdings nach und nach zu einem Umweltproblem. Der Austrag in die Weltmeere führte zu einer zunehmenden Belastung der daraus gewonnenen Lebensmittel. Folglich bilden umfassende rückstandanalytische Untersuchungen von Fisch und anderen marinen Lebensmitteln auf Polyhalogenverbindungen zum Schutze des Verbrauchers vor Belastungen einen Schwerpunkt in der amtlichen Lebensmittelkontrolle.

Bei diesbezüglichen Untersuchungen wurden seit 1999 wiederholt intensive Signale in den zu diesem Zweck aufgenommenen Gaschromatogrammen detektiert, deren Retentionszeiten mit keinem bekannten Schadstoff übereinstimmten [1]. Im Zuge unserer Analysen wurden einige dieser Verbindungen als halogenierte Naturstoffe identifiziert, wobei diese den vom Menschen synthetisierten Schadstoffen strukturell verblüffend ähnlich waren (Abb. 1).

Abbildung 1

Viele der von uns in marinen Lebensmitteln nachgewiesenen halogenierten Naturstoffe werden von Algen und Schwämmen (Abb. 2) und damit von Arten, die schon sehr früh in der Evolution entstanden sind, gebildet. Es ist zu vermuten, dass diese die halogenierten Naturstoffe ebenfalls schon seit vielen Jahrmillionen produzieren [2]. Somit ist es erstaunlich, dass Rückstände von halogenierten Naturstoffen nicht schon eher in Lebensmitteln entdeckt worden sind. Mit Q1 (Abb. 1a) wurde erstmals ein polyhalogenierter Naturstoff in Humanmilch nachgewiesen und damit gezeigt, dass diese Stoffe auch vom Menschen nicht effektiv metabolisiert werden können.

Abbildung 2

Algen und Schwämme können die polyhalogenierten Naturstoffe im Promillebereich ihres Trockengewichts enthalten. Wir vermuten, dass zwar eine Aufnahme durch Algen und Schwämme konsumierende Organismen erfolgt; viel höher schätzen wir jedoch den Anteil ein, der von diesen niederen Organismen an das Umgebungswasser abgegeben wird und dann aus der Wasserphase angereichert wird. Diese Vermutungen basieren auf der Feststellung, dass Fische aus Fischzuchten oftmals vielfach höhere Gehalte an halogenierten Naturstoffen aufweisen als freilebende Fische. Dabei liegt die Ursache nicht in der Belastung des in den Aquakulturen verwendeten Futters, sondern v.a. an der Ansiedlung der Fischfarmen in Ufernähe und damit im natürlichen Lebensraum der Algen und Schwämme.

Zur Untersuchung der Lebensmittel müssen die im Spurenbereich vorliegenden halogenierten Schadstoffe zunächst angereichert werden. Dies geschieht, indem man die übrigen Lebensmittelbestandteile wie Eiweiß, Kohlenhydrate, Wasser und schließlich das Fett sukzessive abtrennt. Auf diese Weise können die Polyhalogenverbindungen aus 20 - 100 Gramm Fischfilet am Ende verlustfrei in einer Lösung, die gerade den Boden eines Fingerhutes füllte, konzentriert werden. Mit entsprechender Analytik können die im gereinigten Extrakt enthaltenen Verbindungen dann hochempfindlich nachgewiesen werden. Taucht in den dabei erhobenen Gaschromatogrammen eine unbekannte Verbindung auf (Abb. 3), wird diese von uns massenspektrometrisch untersucht.

Abbildung 3

Verdichtet sich der Verdacht, dass es sich um einen Naturstoff handelt, müssen größere Mengen an Probe durch Anwendung verschiedener chromatographischer Verfahren aufgereinigt werden, bis eine Strukturaufklärung möglich ist. Auf diese Weise gelang uns u.a. die Strukturermittlung der in Abb. 1a-d gezeigten Naturstoffe. Manche Verbindungen werden dann von uns im Labor synthetisiert (Abb. 1a-b), während andere Stoffe (Abb. 1c-d) zu komplex aufgebaut sind, um sie mit den uns zur Verfügung stehenden Mitteln zu präparieren. In diesem Fall bleibt nur die Isolierung aus dem natürlichen Produzenten.

Wenn der natürliche Produzent bekannt ist und im Lebensraum der belasteten Lebensmittel vorkommt und der Naturstoff chemisch nicht einfach zu synthetisieren ist und somit die Gehalte, wie sie in den Lebensmittelproben vorkommen, nicht auf diese Weise zu erklären sind, ist die Zuordnung eindeutig. Dieser Fall liegt bei den in Abb. 1c-d gezeigten Beispielen vor. Im Falle des in Abb. 1b gezeigten Tetrabromphenoxyanisols war der Nachweis trotz der Ermittlung entsprechender natürlicher Produzenten schwieriger, denn dessen Struktur ähnelt sehr den im Flammschutz in großen Mengen eingesetzten polybromierten Diphenylethern (Abb. 1f). Eine amerikanische Arbeitsgruppe hat daher diese und eine weitere Verbindung in Reinform aus Delfinfett isoliert und mittels Radiocarbonmessungen belegt, dass es sich um Naturstoffe handelt. Dieser Befund gründet sich auf folgende Tatsachen:
Das radioaktive Kohlenstoffisotop ¹⁴C, das permanent in der Atmosphäre gebildet wird, hat eine Halbwertszeit von ca. 5730 Jahren. Liegt Kohlenstoff in einem Molekül gebunden vor, so nimmt der ¹⁴C- Gehalt permanent ab und ist nach ca. 50000 Jahren nicht mehr nachweisbar. Rohstoffe für die chemische Synthese stammen aus der vor Jahrmillionen entstandenen Erdölfraktion, die damit nur sehr alten Kohlenstoff enthält und frei von ¹⁴C ist. Produzieren dagegen Algen und Schwämme die halogenierten Naturstoffe aktuell, liegt ¹⁴C in diesen messbar vor. Durch den Nachweis von ¹⁴C in den Isolaten aus Delfinfett konnte somit der Beweis erbracht werden, dass es sich bei Abb. 1b um einen Naturstoff handelt [3].
Komplexer gestaltet sich der Nachweis der natürlichen Herkunft von Q1 (Abb. 1a). In diesem Fall konnte bisher kein natürlicher Produzent ermittelt werden. Unsere Gewissheit, dass es sich bei Q1 um einen Naturstoff handelt, basiert u.a. auf folgenden Beobachtungen: (a) die chemische Synthese führte nur zu geringen Ausbeuten bei vergleichsweise immensem Aufwand (selbst der unchlorierte 1,2´-Bipyrrol-Grundkörper war zuvor nicht bekannt), so dass eine großtechnische Produktion undenkbar ist; (b) trotz des Nachweises in Proben aus allen sechs Kontinenten, lagen die höchsten Konzentrationen in Proben der südlichen Hemisphäre vor, und dies wurde bisher bei keinem anthropogenen Schadstoff beobachtet; (c) Q1 wurde bisher nur in marinen Proben und in keiner terrestrischen Probe detektiert und (d) der jährliche Verlauf der Q1-Konzentration in Luftproben wich eindeutig von dem anthropogener Schadstoffe ab.

Die Rolle der halogenierten Naturstoffe im Lebensraum Meer ist vielfältig. Mitunter dienen die halogenierten Naturstoffe als Abwehrstoffe gegen Fraßräuber, denen vermutlich evolutionär das Wissen vererbt wurde, dass die den gefährlichen Naturstoff tragende Art als Nahrungsquelle zu meiden ist. Ausgehend von der Tatsache, dass Brom eine gute Austrittsgruppe bei chemischen Synthesen ist, vermuten wir ferner, dass polybromierte Naturstoffe den Organismen als Substrate für die Herstellung größerer und komplexerer Sekundärmetabolite dienen könnten. So sind die weitverbreiteten Bromphenole als Bausteine der Naturstoffe BC-2 (Abb. 1b) und PBHD (Abb. 1d) zu erkennen. Auch ähnelt PBHD strukturell einem Kondensat aus Dibromphenol und MHC-1 (Abb. 1c). Polybromverbindungen werden übrigens auch häufig in Fischölkapseln nachgewiesen. Zwar werden Fischöle i.d.R. physikalisch von PCBs (Abb. 1e) und anderen geregelten Schadstoffen gereinigt, doch greifen die dabei eingesetzten Verfahren nur teilweise für die schwererflüchtigen Polybromverbindungen [4].
Abgesehen vom kritisch einzuschätzenden Akkumulationsverhalten in Seefisch, könnten die halogenierten Naturstoffe evolutionär sogar von Nutzen gewesen sein. So wird vermutet, dass sich parallel zum Auftreten von polyhalogenierten Naturstoffen auch Bakterien entwickelt haben, welche diese Stoffe wieder dehalogenieren können. Diese ebenfalls in Urzeiten entstandenen Bakterien dürften dann wiederum befähigt sein, um anthropogene Schadstoffe wie DDT und PCBs zumindest teilweise abzubauen und uns so vor noch größerem Schaden bewahrt haben [2].

Die toxikologische Prüfung der halogenierten Naturstoffe ist noch nicht abgeschlossen, da es sich schwierig gestaltet, der dafür erforderlichen Menge an hochreiner Substanz habhaft zu werden. Aufgrund der Gehalte an halogenierten Naturstoffen, die wiederholt im mg/kg-Bereich in Fischöl nachgewiesen wurden (Tabelle 1), möchten wir gegenwärtig nicht vom Konsum von Seafood abraten.

Substanz	Gehalte (mg/kg Fett)	Herkunft
Q1	0,1 0,2 14,0	Haileberöl (Neuseeland) Humanmilch (Färöerinseln) Delfinfett (Australien)
BC-2+BC-3	1,6 11,2	Fischölkapseln (Belgien) Delfinfett (Australien)
MHC-1	2,3 1,7	Seelachs (Dänemark) Lachs (Norwegen)
PBHDs	7,0 0,8 1,6	Tiefseefisch (Italien) Wolfsbarsch (Italien) Grünlippmuschel (Neuseeland)
Tabelle 1: Ausgewählte Proben mit hohen Gehalten an halogenierten Naturstoffen

Allerdings sollte es das Ziel sein, die Belastung des Verbrauchers durch halogenierte Naturstoffe nach Möglichkeit zu minimieren. Daher sollte z.B. bei der Planung von Fischfarmen Sorge getragen werden, dass diese nicht im bevorzugten Habitat der kritischen natürlichen Produzenten errichtet werden. Die Suche nach unbekannten Verbindungen und potentiellen Lebensmittelkontaminanten, deren Verhalten in und deren Bedeutung für die Umwelt und unsere Lebensmittel zu ermitteln, sowie die gezielte Suche nach Beantwortung der noch offenen Fragen ist eine interessante Herausforderung, der wir uns in enger Zusammenarbeit mit Kollegen aus aller Welt gerne stellen [5].

	Kontakt Walter Vetter, Natalie Rosenfelder, Simon Gaul, Joachim Melcher Universität Hohenheim Institut für Lebensmittelchemie Fachbereich Lebensmittelchemie 70593 Stuttgart Tel.: +49 (0)711 459-24016 E-Mail: w-vetter@uni-hohenheim.de	Literaturhinweise [1] Walter Vetter (2006): Marine halogenated natural products of environmental and food relevance. Rev. Environ. Contam. Toxicol. 188: 1-57 [2] Walter Vetter, Gordon Gribble (2007): Anthropogenic POPs - Lessons to learn from halogenated natural products. Environ. Toxicol. Chem. 26: 2249-2252 [3] Emma L. Teuten EL, Li Xu, Christopher M. Reddy (2005): Two abundant bioaccumulated halogenated compounds are natural products. Science 307: 917-920 [4] Eunha Hoh, Steven J. Lehotay, Kristin C. Pangallo, Katerina Mastovska, Helen L. Ngo, Christopher M. Reddy, Walter Vetter (2009): Simultaneous quantitation of multiple classes of organohalogen compounds in fish oils with direct sample introduction-comprehensive two-dimensional gas chromatography and time of flight mass spectrometry. J. Agric. Food Chem. (im Druck) [5] http://www.ilc.uni-hohenheim.de/vetter/index.htm
	Kontakt Josef Hiebl Bayerisches Landesamt für Gesundheit und Lebensmittelsicherheit Veterinärstraße 2 85764 Oberschleißheim