Monika Pischetsrieder

Die schnelle Ausbreitung der Rinderkrankheit BSE (Bovine Spongiforme Encephalopathie) und das Auftreten einer neuen Variante der Creutzfeld-Jakob Erkrankung (vCJD), die höchstwahrscheinlich über den Verzehr BSE-infizierter Lebensmittel auf den Menschen übertragen wird, machten die rasche Entwicklung und Einsetzung neuer Verbraucherschutzmaßnahmen notwendig. Bis heute wurden in der EU mehr als 180.000 BSE-Fälle registriert, der überwiegende Teil davon in Großbritannien und Nordirland und etwas mehr als 400 Fälle in Deutschland. Auch heute noch ist BSE ein Thema, jedoch in erheblich geringerem Umfang - 2007 wurden in der EU noch 174 BSE-Fälle gemeldet. Bis heute wurde bei 208 Patienten vCJD diagnostiziert.

Die wichtigsten Maßnahmen stellten sicherlich die obligatorischen BSE-Testungen und das Verfütterungsverbot von Tiermehl dar. Da jedoch die eingesetzten BSE-Tests die Krankheit in einem späten Stadium erkennen und das Tier möglicherweise schon vorher die Krankheit überträgt, wurde zusätzlich noch Spezifiziertes Risikomaterial aus der menschlichen Ernährung ausgeschlossen. Spezifiziertes Risikomaterial ist vor allem Gewebe des zentralen Nervensystems (ZNS), also Hirn und Rückenmark, von älteren Rindern und Schafen. In Deutschland darf darüber hinaus allgemein ZNS-Gewebe nur noch für die Herstellung von Wurst verwendet werden, wenn deklariert wird, dass das Produkt Hirn enthält. Weiterhin müssen Schlachthöfe sicherstellen, dass kein ZNS-Übertrag zwischen Schlachttieren auftritt. Diese rechtlichen Vorgaben erforderten die Entwicklung neuer Testsysteme zum sicheren Nachweis von ZNS-Gewebe in Fleisch und Wurst. An Hand dieses Beispiels soll hier die systematische Entwicklung eines neuen Analyseverfahrens nachvollzogen werden.

Abbildung 1: Schematische Darstellung des Nachweises von PLP in Lebensmitteln mittels Western Blot; 1 Elektrophorese: Abtrennung des PLP von störenden Begleitstoffen 2 Blotting: Übertragung von PLP aus dem Gel auf eine Membran 3 Erkennung von PLP durch einen spezifischen Antikörper 4 Gebundener Antikörper bewirkt die Bildung von Farbstoffmolekülen 5 Die Anwesenheit von PLP erkennt man durch eine farbige Bande auf der Membran

1. Auf der Suche nach neuen Markern für ZNS-Gewebe
   Um den Zusatz von Gehirn oder Rückenmark sicher zu erkennen, braucht man zunächst Markerverbindungen, also charakteristische Inhaltsstoffe von ZNS-Gewebe, die in anderen Organen praktisch nicht vorkommen. Besonders wichtig und schwierig ist dabei die Unterscheidung zwischen peripheren Nerven, die das Fleisch durchziehen, und zentralen Nerven. Prinzipiell können alle Stoffklassen als Marker verwendet werden, einen besonders spezifischen Nachweis kann man aber sehr häufig über Proteine erreichen. Für ZNS-Gewebe charakteristische Proteine können durch eine bioinformatische Analyse entdeckt werden, z. B. durch expressed sequence tags (EST) oder serial analysis of gene expression (SAGE). Dazu werden große Datenbanken durchsucht, in denen die Gene dokumentiert sind, die in den jeweiligen Organen in Proteine umgeschrieben werden. Bei diesen bioinformatischen Analysen fiel Myelin Proteolipid (PLP) auf, das mit einer sehr viel höheren Spezifität in Gehirn und Rückenmark vorkommt als andere Proteine. PLP wurde deshalb für die weitere Testentwicklung herangezogen.

2. Wie kann der Marker von störenden Bestandteilen abgetrennt werden?
   PLP hat für Proteine sehr ungewöhnliche Eigenschaften. Zum Beispiel ist PLP äußerst hydrophob; das heißt, dass PLP sehr gut in organischen Lösungsmitteln löslich ist, während es sich -anders als die meisten Proteine- in Wasser praktisch nicht löst. Diese Eigenschaft kann man für den Nachweis ausnützen. Durch einfache Behandlung der Probe mit verschiedenen Lösungsmitteln kann man PLP sehr gut von den vielen anderen Fleischproteinen abtrennen. Dadurch werden Begleitstoffe aus der Probe entfernt, die das anschließende Nachweisverfahren stören können.

Abbildung 2: Untersuchungen von Wurstproben. Eine dunkle Bande verrät die Anwesenheit von ZNS; 1 Bierwurst 2 Weißwurst 3 Lyoner 4 Paprikaschinkenwurst 5 Zungenwurst 6 negative Kontrolle (Lyoner ohne ZNS) 7 positive Kontrolle (Lyoner mit 0,5% Rückenmark)

3. Wie kann der Marker spezifisch nachgewiesen werden?
   Für den selektiven Nachweis von Proteinen eignen sich immunochemische Methoden. Dies bedeutet, dass Antikörper für die Analytik eingesetzt werden. Diese sind selbst Proteine und können andere Moleküle mit hoher Affinität binden. Die Bindung ist dabei sehr spezifisch, so dass das Zielprotein von einem sehr ähnlichen Protein unterschieden werden kann. Einen Antikörper gegen PLP kann man relativ einfach gewinnen, indem man einen bestimmten Abschnitt des PLP-Proteins synthetisiert und einem Kaninchen injiziert. Entnimmt man dann nach ein paar Wochen Blut, enthält dieses den Antikörper, der an PLP bindet. Die geschickte Auswahl des PLP-Abschnittes, den man für die Antikörpergewinnung nutzt, entscheidet, wie gut sich der Antikörper später für das Testverfahren einsetzen lässt.

4. Aufbau eines Testverfahrens
   Für den Einsatz von Antikörpern gibt es verschiedene Testverfahren, z.B. ELISA, Western Blot oder Dot Blot. Für die Analyse hydrophober Proteine eignet sich vor allem der Western Blot. Dazu werden die Proteine zunächst in einem Gel nach ihrer Größe durch ein elektrisches Feld aufgetrennt (Elektrophorese). Die Proteine werden dann auf eine Membran übertragen, auf der die Reaktion mit den Antikörpern stattfindet. Die Membran wird mit den Antikörpern behandelt, die dabei nur an das passende Protein binden; das heißt, der anti-PLP-Antikörper bindet praktisch nur an das PLP-Protein. Durch eine anschließende Farbreaktion kann die Bindung sichtbar gemacht werden. Dass die Probe PLP enthält, erkennt man durch das Auftreten einer farbigen Bande mit charakteristischer Lage auf der Membran. Mit diesem Testverfahren kann man noch eine Verunreinigung von 0.001 % Hirn in Fleisch nachweisen. Da der Antikörper erhitzte Proteine etwas schlechter erkennt, liegt die Nachweisgrenze von ZNS-Gewebe in Wurst bei ca. 0.1 %.

5. Ein schneller Nachweis für die Schlachtkontrolle
   Bei der Schlachtung wird der Kopf des Tieres vom Rumpf getrennt und das Rückenmark entfernt. Dabei kann ungewollt Rückenmark auf Muskelfleisch geraten. Diese Verunreinigungen befinden sich auf der Oberfläche, so dass die Probennahme deshalb leicht durch einen Abstrich erfolgen kann. Damit ist die Probe sehr viel weniger komplex zusammengesetzt als zum Beispiel eine Wurstprobe, die Substanzen enthalten kann, die den immunochemischen Nachweis stören. Deshalb kann nach einem Abstrichtest ein vereinfachtes Nachweissystem, der Dot Blot, eingesetzt werden. Dazu werden die Proteine nicht aufgetrennt, sondern direkt in der Mischung auf die Membran aufgetragen, wo die Antikörperreaktion stattfindet. Da PLP nur durch die Färbung und nicht wie beim Western Blot durch die spezifische Lage nachgewiesen wird, funktioniert der Test nur, wenn keine Störsubstanzen in der Probe vorhanden sind.

6. Die Optimierung des Tests
   Vor dem Einsatz eines Tests in der Praxis müssen noch viele Parameter optimiert werden. Vor allem wurde versucht Arbeitsschritte zu vermeiden oder zu verkürzen, um die Testdauer deutlich zu reduzieren. Weiterhin ist es vorteilhaft, einen so genannten monoklonalen Antikörper zu entwickeln, der zwar sehr viel aufwendiger in der Herstellung ist, der aber über lange Zeit in gleich bleibender Qualität zur Verfügung steht. Damit kann das Testsystem besser standardisiert werden.

7. Die Anwendung des Tests
   Das fertige Testsystem wurde in Feldstudien und in der amtlichen Lebensmittelüberwachung eingesetzt, um den Zusatz von Gehirn zu Wurstwaren zu untersuchen. In einer repräsentativen Studie wurden 162 Proben von 98 Wurstsorten aus der handwerklichen und industriellen Fertigung getestet. Von diesen Proben waren 147 negativ, während 7 Proben geringe Beimischungen und 8 Proben ganz deutliche Beimischungen zeigten. Im Rahmen der amtlichen Kontrollen wurden 2007 und 2008 588 Wurstproben auf ZNS-Beimischungen untersucht, von denen 7 beanstandet wurden.

Beteiligte Projektpartner

• Prof. Dr. Monika Pischetsrieder, Dr. Barbara Sandmeier, Rainer Bäuerlein
  Henriette Schmidt-Burkhardt Lehrstuhl für Lebensmittelchemie, Emil-Fischer-Centrum, Universität Erlangen-Nürnberg
• Prof. Dr. Cord-Michael Becker, Dr. Carmen Villmann
  Institut für Biochemie, Emil-Fischer-Centrum, Universität Erlangen-Nürnberg
• Prof. Dr. Manfred Gareis, Dr. Antje Hammon, Dr. Tina Düthorn
  Max Rubner-Institut, Kulmbach
• Dr. Gesine Schulze
  Bayerisches Landesamt für Gesundheit und Lebensmittelsicherheit, Erlangen

Schlauer Fuchs

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	Kontakt Prof. Dr. Monika Pischetsrieder Henriette Schmidt-Burkhardt Lehrstuhl für Lebensmittelchemie Department Chemie und Pharmazie Universität Erlangen-Nürnberg Schuhstr. 19 90152 Erlangen Tel.: +49 (0)9131 85-24102 E-Mail: monika.pischetsrieder@lmchemie.uni-erlangen.de	Literaturhinweise [1] Sandmeier B, Villmann C, Düthorn T, Gareis M, Becker C-M, Pischetsrieder M (2007) Detection of central nervous system tissue in meat and meat products with a newly developed immunoassay selective for Myelin proteolipid protein Food Chem. 105: 871-878 [2] Villmann C, Sandmeier B, Seeber S, Hannappel E, Pischetsrieder M, Becker C-M (2007) Myelin proteolipid protein (PLP) as a marker antigen of central nervous system contaminations for routine food control J. Agric. Food Chem. 55: 7114-7123 [3] Hammon A, Düthorn T, Bäuerlein R, Becker C-M, Pischetsrieder M, Pichner R, Gareis M (2007) Immunochemical Detection of central nervous tissue in retail meat products using myelin proteolipid protein (PLP) as marker Arch. Lebensmittelhyg. 58: 214-219 [4] Bäuerlein R, Sandmeier B, Villmann C, Hammon A, Gareis M, Becker C-M, Pischetsrieder M (2008) Development of a dot blot assay for the rapid detection of central nervous system tissue on meat and contact surfaces using myelin proteolipid protein as marker J. Agric. Food Chem. 56: 44-49