Stefan Effkemann

Abbildung 1: Muschelernte im Niedersächsischen Wattenmeer.

Marine Biotoxine sind verantwortlich für eine Reihe von Erkrankungen die im Zusammenhang mit dem Verzehr von Muscheln und Fischen stehen. Weltweit werden jährlich ungefähr 60.000 Vergiftungen dieser Art gemeldet. In ca. 1000 Fällen sterben sogar Menschen.

Die Toxine werden dabei zunächst durch Algen aus der Gruppe der Dinoflagellaten gebildet. Unter günstigen Bedingungen können sich diese explosionsartig vermehren und zu regelrechten Algenblüten führen. Miesmuscheln (Mytilus edulis) filtrieren bis zu 3 L Meereswasser pro Stunde. Die gebildeten Toxine reichern sich bei diesem Prozess in der Muschel an und können nach dem Verzehr durch den Menschen zu unterschiedlichen Vergiftungen führen. Diarrhetic Shellfish Poisoning, kurz DSP, ist der am häufigsten beobachtete Vergiftungstyp. Charakteristische Symptome sind Durchfall, Erbrechen und Krämpfe. Darüber hinaus sind einige Toxine aus dieser Gruppe als Tumorpromotor bekannt. Aus diesen Gründen sind präventive Untersuchungen auf eine mögliche Anwesenheit dieser Substanzen vor dem Inverkehrbringen der Muscheln unerlässlich. In der Regel beginnt die Muschelsaison in Niedersachsen im Juni und endet spätestens gegen Ende des Jahres. Jeweils direkt nach der Ernte erreichen im Wochenturnus Miesmuschelproben das IfF Cuxhaven des LAVES und werden dort vor der Vermarktung binnen 2-3 Tagen auf die mögliche Anwesenheit von Algentoxinen untersucht.

Aufgrund der EU-Entscheidung 2002/225/EG können grundsätzlich sowohl biologische als auch chemisch-analytische Methoden für den Nachweis dieser Toxine eingesetzt werden. Ein Beispiel für ein biologisches Nachweissystem ist der sogenannte Mousebioassay, der immer noch in einigen Ländern der Europäischen Union Verwendung findet. Bei diesem Test wird Muschelmaterial zunächst mit einem Lösungsmittel extrahiert. Anschließend wird der Extrakt nach Aufreinigung drei Mäusen injiziert. Sterben dabei zwei von drei Mäusen binnen 24 Stunden, so ist die Probe als nicht mehr verkehrsfähig zu beurteilen.

Treten Widersprüche zwischen den Ergebnissen beider Verfahren auf, so ist entsprechend der zuvor genannten Gesetzesgrundlage das Ergebnis der biologischen Untersuchung stärker als das der chemisch-analytischen Messung zu gewichten. Dieses führte jedoch in der Vergangenheit nicht nur im Einzelfall zu massiven Problemen. Ein besonders spektakulärer Fall ereignete sich im Jahr 2002.

Trotz EU-weiter präventiver Überwachung erkrankten ca. 30 Personen im Rahmen eines größeren Essens dänischer Muscheln. Daraufhin durchgeführte chemisch-analytische Untersuchungen auf Basis der LC-MS am IfF Cuxhaven des LAVES bestätigten schnell, dass die Muscheln weit über 3000 µg/kg des DSP-Toxins Okadasäure enthielten. Der in der deutschen Fischhygieneverordnung festgeschriebene Grenzwert für diese Toxingruppe liegt bei 400 µg/kg. Recherchen in Kooperation mit den dänischen Behörden führten schnell zu dem Ergebnis, dass die betroffene Muschelpartie im Rahmen der Freigabeprozedur mit Hilfe des Mousebioassays untersucht wurde. Das Ergebnis dieses in Dänemark durchgeführten Versuchs war jedoch im Gegensatz zu der Cuxhavener Analyse negativ. Damit reiht sich dieses falsch negative Ergebnis ein in eine ganze Reihe von Fällen, in denen der Mousebioassay nicht funktionierte.

Aus diesen Gründen und aufgrund der gültigen Tierschutzbestimmungen wird in Deutschland auf den Routineeinsatz dieser Methode verzichtet. Stattdessen finden hier nahezu ausschließlich chemisch-analytische Verfahren für den Nachweis dieser Toxine Anwendung.

Durch die eingangs genannte EU-Entscheidung wurde das innerhalb der DSP-Gruppe zu untersuchende Toxinspektrum stark erweitert. Es umfasst derzeit neben Okadasäure (OA) zusätzlich noch ca. 20 weitere Substanzen aus den Untergruppen der Dinophysistoxine (DTX), Yessotoxine (YTX), Pectenotoxine (PTX) und Azaspirosäuren (AZA). Eine Übersicht über die chemischen Strukturen dieser Verbindungen ist in den Abbildungen 2a-d zusammengestellt.

Abbildungen 2: a-d anklicken zur vergrösserten Ansicht

Bei den Toxinen handelt es sich um polycyclische Verbindungen mittlerer Masse (800-1200 g/mol). Um den Europäischen Vorgaben zu entsprechen und gleichzeitig die Anwendung biologischer Verfahren zu vermeiden, wurde ein neues chemisch-analytisches Verfahren auf Basis der LC-MS/MS-Technik entwickelt. Es ermöglicht eine Simultanbestimmung aller in der Entscheidung aufgeführten Substanzen. Abhängig von ihrer chemischen Struktur lassen sich einige Toxine nur im positiven oder im negativen Elektrospray-Modus ausreichend gut ionisieren. Daher ist die Bestimmung in beiden Ionisationsmodi unerlässlich, um das gesamte Toxinspektrum erfassen zu können.

Die Methodenentwicklung gestaltete sich nicht trivial, da derzeit nur wenige geeignete Standardsubstanzen und Referenzmaterialen für diese Analyten bereits kommerziell verfügbar sind. Stattdessen wurde auf kontaminiertes Muschelmaterial aus verschiedenen Regionen zurückgegriffen. Mit Hilfe dieser Proben gelang es, das Extraktionsverfahren und die zugehörigen Geräteparameter für die jeweiligen Toxine zu optimieren. Die so entwickelte LC-MS/MS-Methode erlaubt es, Muschelproben auf eine mögliche Anwesenheit dieser Toxine zu untersuchen. Bei Verfügbarkeit der entsprechenden Standardsubstanzen (derzeit für Okadasäure, DTX-1, PTX-2 und YTX) ist darüber hinaus auch die quantitative Bestimmung der Toxingehalte möglich. Die Nachweisgrenze für jedes dieser Toxine liegt bei ca. 10 µg/kg. Bedingt durch die hohe Sensitivität dieses Verfahrens kann im Gegensatz zum Mousebioassay ein bevorstehendes DSP-Problem schon frühzeitig erkannt werden, und es können ggf. geeignete Vorsichtsmaßnahmen eingeleitet werden.

In kontaminierten Realproben treten die Toxine oft nicht allein, sondern meist in Kombination auf. Im Gegensatz zu den Alternativmethoden eignet sich das LC-MS/MS-Verfahren dazu, komplette Toxinprofile für diese Proben zu erstellen. Dieses ist am Beispiel zweier Realproben in den Abbildungen 3 und 4 dargestellt.

Abbildung 3: Bestimmung von DSP-Toxinen im positiven Elektrospray-Modus in einer kontaminierten Muschelprobe irischer Herkunft.

Abbildung 4: Bestimmung von DSP-Toxinen im negativen Elektrospray-Modus in einer kontaminierten Muschelprobe neuseeländischer Herkunft.

Neue Verfahren auf Basis der LC-MS/MS-Technik ermöglichen eine äußerst sensitive und selektive Bestimmung von marinen Biotoxinen. Die zeitliche Abschätzung von bevorstehenden Grenzwertüberschreitungen ist möglich. Im Gegensatz zu biologischen Verfahren lässt sich die neu entwickelte Methode bei Verfügbarkeit der entsprechenden Standardsubstanzen problemlos zur Quantifizierung heranziehen und ist zudem noch validierbar.

Deshalb ist hinsichtlich dieser Fragestellungen in vielen Ländern eine Abkehr von biologischen Nachweisverfahren (Mousebioassay) hin zu flüssigchromatographischen Techniken mit massenspektrometrischer Detektion zu verzeichnen. In diesem Zusammenhang ist die in der EU-Entscheidung 2002/225/EG manifestierte Stellung des Mousebioassays als Referenzmethode zum Schutz des Verbrauchers unbedingt zu überdenken.