Winfried Römer und Claudia Steinem

Biosensoren und die biologisch aktive Komponente

Ein Biosensor ist ein kompaktes analytisches Gerät, welches eine biologisch-aktive Komponente enthält, die mit einem Signalwandler verbunden ist und mit dem ein Analyt detektiert werden kann (Abbildung 1). Das Herzstück eines jeden Biosensors ist die biologisch-aktive Komponente. Bereits 1962 hat Prof. Leland C. Clark. Jr. den Grundstein der Biosensorik auf dem New York Academy of Sciences Symposium gesetzt, indem er beschrieb: how "to make electrochemical sensors (pH, polarographic, potentiometric or conductometric) more intelligent" by adding "enzyme transducers as membrane enclosed sandwiches". Dieses Konzept, eine biologisch-aktive Komponente an einen elektrochemischen Signalwandler zu koppeln, konnte er anhand eines Experiments, in dem er ein Enzym, die Glucoseoxidase, an eine Clark-Sauerstoffelektrode durch eine Dialysemembran einschloss, beweisen. Der Abfall der gemessenen Sauerstoffkonzentration war proportional zur Glucose-Konzentration in der Lösung. In seiner Publikation [1] prägte er den Begriff der Enzymelektrode. Heutzutage ist man weit über den Einsatz von Enzymen als biologisch-aktive Komponente hinausgegangen. Es werden neben Enzymen auch Nukleinsäuren für DNA- und RNA-Sensoren und -Arrays sowie Antikörper für Immunosensoren eingesetzt. Eine große Klasse von Biomolekülen steht jedoch für sensorische Anwendungen so gut wie nicht zur Verfügung und das sind die Membranproteine. Und das, obwohl 30 % aller Proteine in den verschiedenen Organismen Membranproteine sind und mehr als 50 % aller Proteine mit Membranen interagieren. Gerade Membranproteine sind für die pharmazeutische Industrie von großer Bedeutung, da fast 15 % der meistverkauften Medikamente auf membranständige Ionenkanäle und etwa 60 % aller rezeptpflichtigen Medikamente auf Membranproteine wirken. D.h. Biosensoren und Screening-Systeme basierend auf Membranproteinen besitzen ein großes Potential für die pharmazeutische Industrie und in der Entwicklung und Erforschung neuer Wirkstoffe.
Doch die Funktionalität von Membranproteinen ist an eine Lipidmembran gebunden. Ionenkanäle sind nur aktiv, wenn sie in einer Lipiddoppelschicht integriert sind. Dies kann eine native Membran sein, wie sie in patch-clamp Experimenten genutzt wird oder eine artifizielle, die nur aus einem Lipid besteht oder aus wenigen Lipidkomponenten aufgebaut ist, wie im Falle freitragender Membranen, die auch als schwarze Membranen (black lipid membranes, BLMs) bekannt sind. Diese Lipiddoppelschichten sind sehr hilfreich bei der Untersuchung von Ionenkanälen und der Wirksamkeit von Inhibitoren, jedoch ist ein Aufbau von Biosensoren nur schwer realisierbar, und eine Chiptechnologie-basierte Strategie wäre hier wünschenswert.

Festkörperunterstützte Lipidmembranen

Eine Möglichkeit, Lipidmembranen mit integrierten Proteinen auf Sensoroberflächen zu verwirklichen, wurde durch die Entwicklung von festkörperunterstützten Lipidmembranen eröffnet. Bereits 1984 beschrieben Brian und McConnell [2], dass es möglich ist, planare Lipidmembranen auf Glasoberflächen durch Fusion von Vesikeln zu erhalten. Heute gibt es eine Vielzahl verschiedener Techniken, die zumeist auf Selbstorganisationsprozessen beruhen und es erlauben, Lipidmembranen auf leitenden und nicht-leitenden Oberflächen zu erzeugen (Abbildung 2). Allerdings sind diese Membranen nicht universell einsetzbar. So ist die Lipidmembran in direktem Kontakt mit der Oberfläche, so dass eine Insertion und die Funktionalität großer Transmembranproteine behindert sein können. Auch ist es nicht möglich, den Transport von Substanzen über Ionenkanäle, Pumpen und Transporter zu verfolgen, da ein zweites wässriges Kompartiment fehlt. Hier wurden und werden Lösungsansätze basierend auf Polymerkissen sowie Lipiden mit längeren Abstandshaltern verfolgt, um diese Membransysteme weiter zu optimieren.

Freitragende Membranen

Soll die Membran tatsächlich zwei wässrige Kompartimente trennen, um die Aktivität von Transportproteinen zu detektieren, so benötigt man eine Lipiddoppelschicht, welche eine Apertur überspannt. Solche Membranen sind in den 70iger Jahren entwickelt worden und werden auch heute eingesetzt, um Ionenkanäle zu untersuchen. Bei diesen Membranen wird ein kleines Loch in einer Teflonfolie mit einer Dicke von 25-50 µm und einem Durchmesser im Bereich weniger 100 µm überspannt (Abbildung 2). Ein sensorischer Einsatz solcher Membranen ist jedoch so gut wie nicht möglich, da weder eine Miniaturisierung und Integration, noch eine Automatisierung und Parallelisierung möglich ist. Aus diesen Gründen sind in den letzten Jahren Anstrengungen gemacht worden, Lipidmembranen über kleine Löcher zu spannen, die sich in Glas, oder Silizium befinden und somit eine Grundlage für eine Sensoroberfläche liefern. Allerdings ist die Stabilität dieser Lipidmembranen zumeist noch zu gering, um sie in der Biosensorik sinnvoll einsetzen zu können.

Nano- und mikro-BLMs

In der Arbeitsgruppe haben wir uns deshalb in den letzten Jahren mit dem Aufbau eines langlebigen Membransystems beschäftigt, welches eine Integration, Miniaturisierung und Automatisierung zulässt. Ausgehend von einem porösen hochgeordneten Material war es das Ziel, ein Membransystem zu entwickeln, welches es erlaubt, angekoppelt an einen festen Träger langzeit- und mechanisch stabile artifizielle Lipidmembranen aufzubauen, in die Ionenkanäle integriert werden können und die es erlauben, Kanalaktivitäten auf Einzelkanalebene zu untersuchen, wie es auch bei freitragenden Membranen und bei der patch-clamp Technik möglich ist. Ausgehend von porösen Aluminaten, die Porendurchmesser von etwa 50 bzw. 280 nm aufweisen (s. Abbildung 3A) und porösem Silizium mit Porendurchmessern von 1 µm konnten Lipidmembranen hergestellt werden, welche die Poren der porösen Materialien überspannen, so genannte nano- und mikro-BLMs (Abbildung 2). Die Ausbildung einer Lipiddoppelschicht auf den porösen Substraten kann elektrisch mittels Impedanzspektroskopie verfolgt werden. Durch Bestimmung der Membrankapazität kann belegt werden, dass es sich um eine Lipiddoppelschicht handelt, die gebildet wird. Gleichzeitig kann der Membranwiderstand bestimmt werden, der im Bereich von mehreren Gigaohm liegen muss, um Ionenkanalmessungen durchführen zu können. Im Falle von patch-clamp Messungen wird ebenfalls ein sogenannter "Gigaseal" mit der Pipette angestrebt, um rauscharme Einzelkanalmessungen durchführen zu können, im Falle von klassischen freitragenden Membranen wird aus dem selben Grund versucht, sehr hochohmige Membranen mit spezifischen Membranwiderständen von 10⁶-10⁸ W cm² zu erzielen. Jedoch ist die Stabilität dieser Membranen recht begrenzt und liegt typischerweise nur im Bereich von mehreren Stunden. Die nano-BLMs auf porösem Aluminat weisen eine sehr interessante Eigenschaft bezüglich des Membranwiderstands auf. Der Membranwiderstand ist ähnlich hoch wie bei klassischen BLMs, sinkt jedoch langsam über die Zeit ab und nicht in einem alles-oder-nichts-Prozess, wie man es von BLMs kennt (Abbildung 3B). Zudem ist der Membranwiderstand für eine lange Zeit so hoch, dass Einzelkanalmessungen durchgeführt werden können.
Der hohe Membranwiderstand der mikro- und nano-BLMs erlaubt die Messung von Proteinpumpen und -kanälen an einem langzeitstabilen System. So konnten bereits Insertionen und Einzelkanalaktivitäten von Peptiden wie Gramicidin (Abbildung 3C) [3] und Alamethicin sowie des Peptids Vpu aus HIV-1 [4] in nano- und mikro-BLMs beobachtet werden, aber auch Kanalaktivitäten von großen Transmembranproteinen wie des outer membrane proteins F (OmpF) aus E. coli.
Da mikro- und nano-BLMs auf leicht herstellbaren porösen Oberflächen beruhen, ist es denkbar, sie in eine Chip-basierte Array-Technologie münden zu lassen, so dass sie eingesetzt werden könnten, um z.B. nach Antagonisten für Ionenkanäle zu suchen oder den Einfluss von Pharmaka auf Transporter zu screenen.