Gerald Steiner

Die Detektion von Biochips oder Biosensorarrays ist gewiss kein grundlegend neues Gebiet. Immunoarrays und DNA-Chips sind seit Jahren Routine. Die Detektion der biochemischen Wechselwirkungen wird zum Beispiel elektrochemisch oder mittels Fluoreszenzmarker vorgenommen. Diese Methoden sind zwar sehr sensitiv, stoßen aber mit den Anforderungen neuer Biosensorarrays schnell an ihre Grenzen. Insbesondere unter dem Blickwinkel von Proteomics werden Detektionsmethoden benötigt, die weder eine Labelung erfordern noch Rückwirkungen auf die Moleküle zeigen. Diese Forderungen, kombiniert mit einer schnellen und parallelen Detektion, werden von optischen Methoden bestens erfüllt. Aufgrund ihrer hohen Sensitivität sind interferometrische und resonanzspektroskopische Verfahren besonders geeignet. Im Folgenden soll die Oberflächenplasmonen-Resonanz als eine Methode für das Lesen von Biochips vorgestellt werden.

Die Oberflächenplasmonen-Resonanz (engl.: surface plasmon resonance - SPR) ist eine oberflächensensitive Methode zur Erfassung von minimalen Änderungen des Brechungsindexes oder der Schichtdicke sehr dünner Filme. Die SPR wird seit vielen Jahren vorzugsweise zur Detektion kompetiver und rezeptiver Bindungsprozesse zwischen Biomolekülen eingesetzt. Seit kurzem wird die SPR zunehmend auch als Imagingmethode für das Lesen von Biosensorarrays angewendet. Das SPR-Imaging gestattet mit hoher Empfindlichkeit Änderungen des Brechungsindexes oder der Schichtdicke abzubilden.
Zum besseren Verständnis des SPR-Imaging soll zunächst kurz die klassische, nicht flächenaufgelöste SPR kurz erläutert werden. Für die Anregung der Oberflächenplasmonen ist ein optisches Prisma mit einem etwa 50 nm dicken Metallfilm erforderlich. An der Grenzschicht Glasprisma-Metallfilm wird Licht totalreflektiert. Das evaneszente Feld des totalreflektierten Lichtes regt bei bestimmten Bedingungen, den sog. Resonanzbedingungen , die Plasmonenwelle an. In dem Metallfilm schwingen die Leitungselektronen mit einer Resonanzfrequenz, die sowohl durch Metall- und Grenzflächeneigenschaften als auch durch die Wellenlänge und den Einfallswinkel des Lichtes bestimmt wird. Die Anregung der Plasmonenwelle und die damit verbundene Übertragung der Energie des Lichtes auf die Elektronen in dem Metallfilm zeigt sich im reflektierten Licht als stark verminderte Intensität. Das Reflexionsminimum wird winkelabhängig erfasst. Da die Grenzflächeneigenschaften direkt den Einflüssen der Umgebung unterliegen, führen Änderungen in unmittelbarer Nähe der Metallschicht zu einer Verschiebung der Resonanzfrequenz. Die Verschiebung der Reflektivitätskurve ist leicht erkennbar und messbar. Aus der Lage bzw. der Verschiebung der Resonanzfrequenz lassen sich im Fall der Biosensoren Rückschlüsse auf Adsorptionsprozesse an oder nahe der Metalloberfläche ziehen.

Abbildung 1: (a) Prinzip des SPR-Imaging. Der Metallfilm wird mit einem parallelen und monochromatischen Lichtstrahl unter dem Winkel a beleuchtet. Der CCD-Detektor erfasst die Verteilung der reflektierten Intensität. (b) Tritt eine Verschiebung der SPR, z.B. durch ein Bindungsereignis in einem Spot auf, verändert sich auch die Intensität des reflektierten Lichtes. Dadurch bildet sich das Analyt-Array als Hell-Dunkel-Muster der Spots auf dem Detektor ab.

In den vergangenen Jahren hat sich der Schwerpunkt von SPR-Imaging Messungen eindeutig von der Charakterisierung ultradünner Filme hin zur Detektion von Biosensorarrays verschoben. In der Literatur sind eine Vielzahl von Anwendungen für das Lesen von Affinitätssensorarrays beschrieben. So konnten mit dem SPR-Imaging flächenaufgelöst Wechselwirkungen zwischen DNA/DNA, DNA/Protein oder Protein/Protein abgebildet werden. Als Beispiel zeigt die Abb. 2 das SPR-Image eines DNA-Biochips.

Abbildung 2: SPR-Image eines DNA-Chips. In dem Falschfarbenbild heben sich die blauen DNA-Spots deutlich von dem Substrat ab.

Abbildung 3: Prinzip eines Ionenkanal-Sensorarrays. In einer mikrostrukturierten Polymerschichten werden Ionenkanäle mit einem umgebenden Lipidfilm integriert. Öffnet der Ionenkanal infolge Anbindung eines Liganden strömen Ionen in das Reservoir. Die Änderung der Ionenkonzentration wird mittels SPR-Imaging detektiert.

Kaum eine andere label-freie Detektionsmethode besitzt eine so hohe Empfindlichkeit, lässt sich für paralleles und schnelles Lesen von Biochips einsetzen und ist zudem einfach anwendbar wie das SPR-Imaging. In jüngster Zeit rückt das SPR-Imaging mit der fortschreitenden Entwicklung von DNA- und Proteinchips zunehmend in das Interesse der analytischen Biochemie. Es lassen sich sowohl Bindungs- als auch Transportprozesse flächenaufgelöst detektieren. Was die technische Seite angeht, so sind zur Zeit noch überwiegend "Eigenbaugeräte" in Forschungs- und Entwicklungslabors im Einsatz. Seit kurzer Zeit sind aber auch SPR-Imaging Gerätesysteme kommerziell erhältlich. Die Entwicklungen dürften sich in zwei Richtungen bewegen. Zum einen wird an Oberflächenbeschichtungen zur Unterdrückung der unspezifischen Adsorption gearbeitet, zum anderen verschiebt sich die Wellenlänge des Messlichtes zunehmend von den klassischen "roten" Lichtquelle in das nahe Infrarot (NIR). Der Vorteil liegt auf der Hand: im NIR lassen sich neben den üblichen Glassubstraten auch Silizium für Biochips einsetzen. Zudem wird die Resonanzkurve "schärfer", wodurch die Empfindlichkeit steigt.