„Moderne Verfahren zur Isolierung, Trennung und Strukturaufklärung wertvoller Substanzen aus der Natur“

Christoph Meyer, Christof Krieg und Klaus Albert

I Einleitung:

Abbildung 1: Aufarbeitung von mit deuteriertem Wasser gezüchtetem Spinat

Die Isolierung eines Analyten aus einer biologischen Probe (Abbildung 1) ist der zeitaufwendigste und am stärksten fehlerbehaftete Schritt einer Analyse. Falsche Probenaufbereitung führt bei instabilen Analyten zu Isomerisierung oder Zerstörung des Analyten. Andererseits wird der Analyt oft nicht quantitativ aus einer biologischen Matrix herausgelöst. Neben der konventionellen Flüssig-flüssig-Extraktion wurden in der Arbeitsgruppe verschiedene effektive Methoden der Extraktion wie Solid Phase Extraction (SPE), Matrix Solid Phase Dispersion (MSPD), sowie der Anreicherung mit Restricted Access Materialien (RAM) etabliert. Durch die Anwendung dieser Extraktionsverfahren wird zum einen die Oxidation bzw. Isomerisierung der Wirkstoffe (z.B. der licht- und sauerstoffempfindlichen Carotinoide) verhindert und zugleich eine Anreicherung und Aufkonzentrierung des Analyten erreicht. Zur Stofftrennung werden chromatographische Trennmethoden eingesetzt. Allen gemeinsam ist, dass die Trennung eines Stoffgemische zwischen zwei unterschiedlichen Phasen, einer stationären und einer mobilen, erfolgt. Unser Arbeitskreis beschäftigt sich sowohl mit der Entwicklung neuer, auf bestimmte Trennprobleme maßgeschneideter Trennmaterialien, als auch mit der analytischen Anwendung dieser Phasen für chromatographische Trennprobleme.

Die Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie (High Performance Liquid Chromatography, HPLC) ist ein physikalisch-chemischer Trennprozess, bei dem sich ein Analytgemisch zwischen einer flüssigen mobilen und einer festen stationären Phase verteilt. Daraus resultieren unterschiedliche Verweilzeiten der Analyten in den Poren der stationären Phase und somit eine Auftrennung dieser durch das Trennmedium. Als Trennmedium dienen gepackte Trennsäulen, durch die die mobile Phase mittels kontinuierlich angelegtem Druck getrieben wird. Als Trennmaterialen werden zumeist mit organischen Molekülen modifizierte druckstabile Kieselgele (Abbildung 2), sogenannte Umkehrphasen (Reversed Phase, RP) eingesetzt.

Um allerdings für verschiedene Trennprobleme die geeignete Trennmaterialien zur Verfügung zu haben, muss der Trennprozeß auf molekularer Ebene verstanden werden. Hierbei bietet sich die Festkörper-NMR-Spektroskopie zur Charakterisierung der Materialien an. Die Suspension-Magic-Angel-Spinning-NMR-Spektroskopie wird zur Aufklärung der verschiedenen Wechselwirkungsprozesse zwischen Analytmolekülen und der stationären Phase in Anwesenheit der mobilen Phase verwendet. Die hervorragende Trennleistung der von uns entwickelten polymerbasierten Trennmaterialien beruht hier auf der Tatsache, dass starr angeordenete unpolare Alkylketten eine bessere Wechselwirkung mit dem Analytmolekülen ermöglichen (Abbildung 3).

Die HPLC hat eine dominante Rolle in der Arzneimittelanalytik (Forschung, Entwicklung, Kontrolle) und der biomedizinischen Analytik eingenommen. Ziel ist es, Wirkstoffe und deren Abbauprodukte (Metabolite) in komplexen Matrizes (Plasma, Serum, Urin, Sekrete, usw.) sicher zu bestimmen. Dabei liegt die Problematik in der geringen Konzentration dieser Substanzen (Nanogramm bis Mikrogramm pro Milliliter Körperflussigkeit). Der Schwerpunkt unseres Arbeitskreises ist die Analytik von Carotinoiden, Vitaminen und Flavenoiden.

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II Miniaturisierung chromatographischer Trenntechniken: Kapillarsäulen

Heute werden in chromatographischen Trennungen meist Säulen mit 4,6 mm Innendurchmesser verwendet. Es gibt aber viele Gründe, die Säulendimensionen zu verringern. Insbesondere kann dadurch der Lösungsmittelverbrauch reduziert werden. Außerdem steht meist nur eine sehr geringe Probenmenge zur Verfügung. Mit sogenannten Kapillarsäulen werden Analysen bis in den Picogrammbereich möglich. Zusätzlich wird die Nachweisempfindlichkeit in gekoppelten Systemen wie LC-NMR verbessert.

III Direktkopplung der miniaturisierten Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie mit der Kernmagnetischen Resonanzspektroskopie (capLC-NMR) zur Strukturbestimmung von unbekannten Verbindungen

Die schonende und zerstörungsfreie Analytik von biologisch aktiven Wirkstoffen gelingt durch die Anwendung neuer on-line Kopplungsverfahren zur gleichzeitigen Auftrennung und Strukturanalytik komplexer Substanzgemische. Der Vorteil der gekoppelten Trenn- und Identifizierungsmethoden besteht neben der Zeitersparnis vor allem darin, dass in dem geschlossenen Trenn- und Spektroskopiesystem eine Zersetzung der zu untersuchenden Verbindungen unmöglich ist. Die Auftrennung von unpolaren Wirkstoffen wird durch Verwendung der in der Arbeitsgruppe entwickelten hochselektiven polymerbasierten Trennphasen ermöglicht. Die NMR-Spektroskopie ist trotz ihrer relativen Unempfindlichkeit die einzige Methode, die eine eindeutige Strukturzuordnung von beispielsweise Carotinoid-Stereoisomeren im µg-Bereich liefern kann. Da die unsere Polymerbasierten Trennphasen eine höhere Selektivität und Kapazität als C18-Phasen aufweisen, können sie für HPLC-NMR-Experimente deutlich höher beladen werden, womit der Nachteil der geringen Sensitivität zumindest teilweise ausgeglichen werden kann. So wird eine höhere Probenkonzentrationen in der NMR-Meßzelle erreicht. Abbildung 4 zeigt den experimentellen Aufbau der Kapillar LC-NMR Anlage.

Abbildung 4: Experimentelle Anordnung für die Kapillar HPLC NMR Kopplung

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Christoph Meyer, Christof Krieg und Klaus Albert Eberhard-Karls-Universität Tübingen Institut für Organische Chemie Arbeitskreis von Prof. Dr. Klaus Albert Auf der Morgenstelle 18 72076 Tübingen, E-Mail: christoph.meyer@uni-tuebingen.de christof.krieg@uni-tuebingen.de oder klaus.albert@uni-tuebingen.de