„Schnelle und effiziente Trennungen mit Hilfe von stationären Phasen auf der Basis von porösem Kieselgel mit Teilchendurchmessern von kleiner 2 µm“

Stefan Lamotte, Rainer Brindle, Klaus Bischoff und Peter Dietrich

Einleitung

Die Anforderungen moderner Analysenmethoden sind heute immer mehr an die Geschwindigkeit gekoppelt. So sind auch HPLC-Trennungen mit Analysenzeiten von 30 bis 60 Minuten nicht mehr zeitgemäß. Immer häufiger werden kurze Trennsäulen mit kleinen Teilchen für die schnelle HPLC eingesetzt. Die Diskussion um den Einsatz kleiner Teilchen in der HPLC begann bereits vor 30 Jahren. Bereits 1975 veröffentlichte Istvan Halász im Journal of Chromatography einen Artikel mit dem Titel "Ultimate limits in High Performance Liquid Chromatography" (1). In diesem Artikel sagte Halász bereits voraus, dass die optimale Teilchengröße eines HPLC Trägers bei etwa 1 µm liegen wird. Zu dieser Zeit war man noch nicht in der Lage solche Materialien mit einer guten Korngrößenverteilung herzustellen. Ebenso waren die existierenden HPLC-Geräte noch nicht auf die Erfordernisse hinsichtlich der Verwendung kurzer Trennsäulen optimiert.
Heute besitzen wir die Technologie, kleine Partikel reproduzierbar herzustellen. Gleichzeitig hat sich auch die Qualität der Geräte hinsichtlich der Verwendung kurzer Säulen mit kleinen Teilchen deutlich verbessert. Neben der Möglichkeit, mit höheren Gegendrucken arbeiten zu können, haben modernere HPLC- Apparaturen auch geringere Volumina zwischen Injektionseinheit und Detektor, was den Einsatz kurzer Säulen erst ermöglicht.

Die schnelle HPLC

Warum sollten jedoch möglichst kurze Trennsäulen, die mit kleinen Teilchen gefüllt sind verwendet werden? Die Antwort gibt die van Deemter Kurve in Abbildung 1. Diese Säulen können bei sehr hohen linearen Flussgeschwindigkeiten betrieben werden, ohne dass Trenneffizienz verloren geht. Da mit kleineren Teilchen auch kleinere theoretische Bodenhöhen und somit höhere Bodenzahlen erreicht werden können, reicht bereits eine wesentlich kürzere Trennsäulen, um die gleiche Trenneffizienz einer langen Säule mit größeren Teilchen zu erreichen. Daher kommt es bei der Verwendung von kurzen Säulen, die mit kleinen Teilchen gefüllt sind, immer zu einer Beschleunigung der Analysenzeit.

In Abbildung 2 ist im direkten Vergleich die Trennung eines Testgemisches auf einer 5µm Säule (ProntoSIL 120-5-C18 ace-EPS) und einer 1.8 µm Säule (ProntoPEARL 60-1.8-C18 ace-EPS) dargestellt. Beide Säulen besitzen mit einer Bodenzahl von 11.000 die gleiche Trenneffizienz und zeigen die gleiche Auflösung für die interessierenden Komponenten. Die Trennung auf der kurzen Säule ist jedoch wesentlich schneller. Deutlich erkennbar sind auch die schmäleren und höheren Signale auf der kürzeren Säule. Kürzere Säulen mit kleineren Teilchen führen also auch zu einer höheren Massenempfindlichkeit. Da jedoch der Gegendruck eines gefüllten Rohres nach dem Gesetz von Darcy mit dem Quadrat des reziproken Teilchendurchmessers steigt, während die Länge der Säulen lediglich linear in den Druckabfall eingeht, produzieren kürzere Säulen mit kleinen Teilchen einen deutlich höheren Gegendruck als entsprechend längere Säulen, die mit größeren Teilchen gefüllt sind. Daher liegt der Druckabfall einer 50mm langen Säule bei der idealen linearen Strömungsgeschwindigkeit von 5 mm/s (das entspricht bei einer Säule mit dem Innendurchmesser von 4.6 mm einem Volumenfluß von etwa 2.5 ml/min) in Abhängigkeit vom Eluenten zwischen 30 und 40 MPa (4300 bis 5700 psi). Da der Druckabfall über einer Säule auch maßgeblich von der Viskosität des Eluenten und diese wiederum sehr stark von der Temperatur abhängig ist, kann der Druckabfall stark durch die Erhöhung der Temperatur reduziert werden. Diese Temperaturerhöhung führt zusätzlich zu einer weiteren Beschleunigung der Analysengeschwindigkeit. Es empfiehlt sich daher, bei der Chromatographie mit ProntoPEARL TPP _sub2 Säulen bei Temperaturen zwischen 60°C und 90°C zu arbeiten.
Beim Arbeiten mit kurzen Säulen müssen aber auch noch weitere Parameter beachtet werden. Da die Peaks in sehr kurzer Zeit von der Trennsäule eluiert werden und zudem nur wenige Sekunden breit sind, wird eine hohe Datenaufnahmerate der Software erforderlich. Um einen chromatographischen Peak fehlerfrei quantifizieren zu können, werden 20 bis 30 Datenpunkte benötigt. Die für die Trennung benötigte Datenaufnahmerate kann mit folgender Gleichung berechnet werden:

wobei: sf: Datenaufnahmerate in [Hz] L: Länge der Trennsäule in [m] H: Theoretische Bodenhöhe in [µm] t: Retentionszeit in [s]

Trägt man die Datenaufnahmerate gegen die theoretische Bodenhöhe auf (Abb. 3), so sieht man, dass v.a. früh eluierende Verbindungen hohe Datenaufnahmeraten benötigen. Daher sollte bei der Verwendung von Säulen, die küzer als 50 mm sind, standardmäßig eine Datenaufnahmerate von mindestens 50 bis 60 Hz verwendet werden.
Mit kurzen Säulen kann durchaus auf herkömmlichen HPLC Anlagen gearbeitet werden. Da jedoch das Volumen der Trennsäule kleiner als bei Standardtrennsäulen ist, sollten alle Verbindungen die zur chromatographischen Bandenverbreiterung beitragen können (Volumina der Injektionseinheit, alle Kapillarzuleitungen zwischen Säule und Detektor, Detektorzellvolumen) minimiert werden. Als Faustregel gilt allgemein, dass das Volumen zwischen Injektionseinheit und Detektor 10% des Säulenvolumens nicht überschreiten sollte. Dabei ist v.a. auf einen sauber gearbeiteten und totvolumenarmen Einbau der Säule zu achten. Die von Bischoff verwendete HYPERCHROME Säulenhardware bietet hier eine optimale Kopplungsmöglichkeit, da durch die direkte Kopplung und die Zuführung der Kapillare bis zum Säulenbett eine ideale Verbindung geschaffen wird (Abb.4). Durch den kompletten Verzicht von Schneidringen und Fittingschrauben kann es weder zu Totvolumina bei der Kopplung, noch zu Undichtigkeiten kommen.

Applikationsbeispiel

Der Einsatz der ProntoPEARL TPP _sub2 Säulen wird im folgenden Applikationsbeispiel gezeigt. Die Apparatur besteht aus einer Bischoff 2250 HPLC-Pumpe, einem Bischoff DAD 3L Dreiwellenlängen UV Detektor einem Bischoff Variotherm 4110 Säulenofen, und einem Alcott 718 AL Autosampler. Die Datenaufnahme erfolgt mittels der McDacq Control Software (Bischoff). Zur herkömmlichen Konfiguration der HPLC- Anlage wurden lediglich zwei kleine Änderungen durchgeführt: Es wurden 0.1mm Kapillarzuleitungen zwischen Säule und Detektor verwendet und die Datenaufnahmerate auf 60 Hz gesetzt.
Abb. 5 & 6 zeigen eine isokratische Methode zur Bestimmung von polyphenolischen Verbindungen in Rotwein. Für die Methode verwendeten wir eine ProntoPEARL TPP sub2 C8 ace-EPS Säule in der Dimension 50 x 4.6 mm. Bei der stationären Phase handelt es sich um eine C8 -Phase mit eingebundener polarer Gruppe in der Seitenkette. Dieser Säulentyp zeigt generell eine höhere Retention für saure Verbindungen im Vergleich zu klassischen Umkehrphasen. Ferner gelingt damit die Auftrennung von cis und trans Resveratrol. Daher gelingt es mit dieser Methode die Polyphenole nach der Matrix von der Säule zu eluieren und somit auf eine zeitaufwändige und unter Umständen fehlerbehaftete Probenvorbereitung zu verzichten. Abb. 6 zeigt das Chromatogramm eines Pfälzer Rotweines (Fritz Walter, Regent Trocken, Pfalz 2001). Der Wein wurde lediglich durch einen 0.2 µm Spritzenfilter filtriert und dann direkt injiziert. Es wurden hohe Konzentrationen an Myrecitin, Resveratrol und Quercitin gefunden.

Fazit:

Mit Hilfe der neuen stationären Phasen mit Teilchengrößen von kleiner 2 µm können selbst sehr komplexe Trennungen in kurzen Analysenzeiten mit konventionellen HPLC-Anlagen durchgeführt werden.

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Dr. Stefan Lamotte Bereichsleiter HPLC-Säulen Bischoff Chromatography Böblinger Str. 23 71229 Leonberg Tel.: +49 (0)7152 606450 Fax: +49 (0)7152 606435 E-Mail: lamotte@bischoff-chrom.de

Klaus Bischoff Managing Director Bischoff Analysentechnik u.-geräte GmbH Böblinger Str. 23 71229 Leonberg Tel.: +49 (0)7152 606432 Fax: +49 (0)7152 606435 E-Mail: bischoff@bischoff-chrom.de

Dr. Rainer Brindle, Peter Dietrich, Bischoff Analysentechnik u. -geräte GmbH Böblinger Str. 23 71229 Leonberg