Simone Günther, Alexander Jung, Ulf Vogt und Michael Steinwand

Einleitung:

Nach der Entschlüsselung des menschlichen Genoms ist in den letzten Jahren die Erforschung von sogenannten Volkskrankheiten wie Diabetes, Krebs oder Herz-Kreislauferkrankungen in den Mittelpunkt des Interesses gerückt. Bei vielen dieser Erkrankungen geht man davon aus, dass mehrere Gene sowie Umwelteinflüsse und individuelle Lebensgewohnheiten ursächlich für die Pathogenese und das Krankheitsbild verantwortlich sind. Aus diesem Grund werden sie als polygene, multifaktorielle oder komplexe Krankheiten bezeichnet. Bei der Erforschung der beteiligten Gene steht man gegenwärtig noch ziemlich am Anfang. Dies hängt damit zusammen, dass die am Krankheitsbild beteiligten Gene einzeln betrachtet häufig das Krankheitsrisiko nur geringfügig beeinflussen, was ihre Identifizierung erschwert. Ein Ansatz zur Identifizierung dieser Gene ist der Vergleich der Genaktivität in den Geweben gesunder und kranker Menschen. Entscheidend hierbei ist, dass mit diesem Ansatz die Gesamtheit aller Gene erfasst werden kann. Diese vergleichende "Genexpressionanalyse" ermöglicht es dann, Gruppen von Genen zu beschreiben, die signifikant für das entsprechende Krankheitsbild stehen. Diese Gruppen werden im allgemeinen als Gensignaturen bezeichnet. Gensignaturen bzw. die entsprechenden Genexpressions-analysen finden nicht nur bei der Erfassung bzw Charakterisierung eines Krankheitsbildes ihre Anwendung, sondern sollen auch Aussagen zum Beispiel über den Krankheitsverlauf ermöglichen. Auch ist es in der Krebsdiagnostik heute zum Teil schon möglich Tumoren zu klassifizieren und die Erfolgsaussichten verschiedener Therapieformen zu beurteilen. Allgemein wird diesem Zweig der sogenannten präventiven Medizin für die Zukunft eine bedeutende Rolle zugewiesen. Ein Beispiel einer solchen Awendung sowie die technischen Grundlagen der analytischen Methode sollen hier näher besprochen werden.

Technische Grundlagen und Analytische Methode
Vergleichende Genexpressionsanalyse

Um den unterschiedlichen Genexpressionsstatus im erkrankten gegenüber dem gesunden Organismus festzustellen, wird von einem bestimmten Gewebe, einer Biopsie oder Blut von kranken und gesunden Individuen die sogenannte vergleichende Genexpressionsanalyse durchgeführt. Der Begriff an sich ist möglicherweise etwas irreführend, da nicht die Gene direkt, sondern die Konzentration ihrer Transkriptionsprodukte in den Zellen, die sog. messenger RNA oder mRNA bestimmt wird. Die Methode, welche hierzu etabliert ist beruht auf der Hybridisierung einzelner dieser Transkriptionsprodukten an genspezifische Sonden. Diese sind im Falle eines Mikroarray Experiments auf der Oberfläche desselben in Form von Spots chemisch aufgebracht worden. Insgesamt besteht das Mikroarray dieser Studie aus etwa 31.000 Sonden, welche ca. 29.000 menschliche Gene repräsentieren. Die übrigen Sonden werden für die Referenzierung der Analyse benötigt. Die folgende Abbildung zeigt einen Ausschnitt eines solchen Mikroarrays.

Abbildung 1: Ausschnitt aus einem Microarray-Bild

Das analytische Grundprinzip lässt sich bereits an diesem Bild erkennen. Die regelmäßig aufgebrachten einzelnen Sonden leuchten unterschiedlich stark (oder überhaupt nicht). Leuchtende Spots bedeuten, dass das betreffende Gen in der Probe "aktiv" war, das es also in mRNA übersetzt in der Zelle vorlag. Die Leuchtstärke der Spots ist dabei ein Maß für die "Expression" jedes Gens in mRNA.

Probennahme und Probenvorbereitung

Mit den Reagenzien des 1700 Expression Array Systems können Patientenproben in eine Form überführt werden, in der sie mit der Chemolumineszenztechnik detektiert werden können. Der wichtigste Schritt nach der Extraktion der mRNA aus den Gewebezellen der Patientenprobe ist das enzymatische Umschreiben der mRNA in cDNA (Reverse Transkription). Dabei wird gleichzeitig ein Digoxigenin Marker (DIG) in das jeweilige cDNA Molekül eingeführt, welcher zur späteren Detektion benötigt wird. Die folgende Abbildung veranschaulicht den beschriebenen Prozess. Die so hergestellte cDNA kann wenn nötig durch lineare Amplifikation noch weiter vervielfältigt werden.

Abbildung 2: Umschreiben der mRNA in gereinigte, DIG-markierte cDNA.

Hybridisierung und Detektion

Die so umgeschriebenen cDNA Moleküle werden daraufhin auf dem Microarray hybridisiert. Das bedeutet, dass jede Sonde (Bei den Sonden handelt es sich um Oligomere aus 60 DNA Basen, sog. 60-mere), welche auf dem Array immobilisiert vorliegt, potentiell komplementär zu einer DNA der Probe sein kann. Falls der entsprechende Strang in der Probenlösung vorhanden ist, wird er an dieser Stelle an die Sonden-DNA binden ("hybridisieren"). In einem weiteren Schritt bindet ein Konjugat bestehend aus einem anti-Digoxigenin Antikörper und alkalischer Phosphatase an das Digoxigenin der hybridisierten cDNA.
Nachfolgend wird nun durch eine (bio-)chemische Reaktion an der alkalischen Phosphatase Licht erzeugt, das letztlich von einer CCD Kamera im Gerät detektiert wird. Die Nachweisgrenze liegt bei dieser Konfiguration bei ca. 10 fmol für cDNA. Dabei werden etwa 100 Nanogramm Gesamt-RNA benötigt, welche aus ca. 25.000 Zellen eines Gewebes extrahiert werden kann.
Abbildung 3 zeigt diese Reaktionsschritte nochmals schematisch.

Abbildung 3: Beschreibung der Hybridisierung und Antikörper-Bindung an einem Spot (grau) des Microarrays. Durch Zugabe der Chemolumineszenz-Reagenzien (Enhancer) wird Licht auf dem Spot erzeugt.

Zum Auslesen der hybridisierten Mikroarrays wird beispielsweise das Applied Biosystems 1700 System verwendet, welches in folgender Abbildung dargestellt ist. Es enthält ein optisches System mit Kamera und Filtern zur Detektion der Chemolumineszenz sowie Software zur Bilderfassung und Auswertung.

Abbildung 4: Der 1700 Chemolumineszenz Microarray Analyzer - ein Teil des Applied Biosystems 1700 Expression Array Systems- misst die von den Microarrays ausgehende Chemolumineszenz und ermöglicht eine Detektion von weniger als einem Femtomol exprimierter mRNA.

Datenauswertung und Ergebnis

War ein Gen in der ursprünglichen Probenlösung vorhanden ("exprimiert"), dann wird der entsprechende Spot auf dem Microarray aufleuchten. Die Leuchtstärke (Intensität) ist ein Maß für die Konzentration des Genprodukts im untersuchten Gewebe.
Wie werden nun Experimente in unserem oben beschriebenen Anwendungsfeld durchgeführt? Es werden die beschriebenen Microarray-Experimente für verschiedene Patientenproben durchgeführt und verglichen, wie in der nachfolgenden Abbildung illustriert.

Abbildung 5: Prinzipieller Ablauf einer vergleichenden Genexpressionsanalyse.

Durch diesen Vergleich lassen sich Gene bestimmen, welche sich im kranken Gewebe anders verhalten, als im gesunden, also beispielsweise viel stärker oder schwächer "exprimiert", oder eventuell gar nicht mehr aktiv ("ausgeschaltet") sind. Andere Gene könnten auch nur im kranken Gewebe aktiv sein und im gesunden überhaupt nicht.
Durch diese Auswertung erhalten die Forscher wertvolle Informationen über die möglicherweise am Krankheitsverlauf beteiligten Gene und Signalwege und können daraus weitere Forschungsaktivitäten im Hinblick auf neue Therapien oder Diagnostik ableiten.
Im folgenden Beispiel einer Brustkrebsstudie, die mit dieser Methode durchgeführt wurde, soll dieses Prinzip an einem praktischen Beispiel veranschaulicht werden.

Voroperative Chemotherapie bei Brustkrebs und der Einsatz der Genexpressionsanalyse
Einführung - neoadjuvante Chemotherapie

Häufig wird eine Chemotherapie erst nach Entfernung eines bösartigen Brusttumors mit der Patientin besprochen und durchgeführt. Nachdem in mehreren großen Untersuchungen nachgewiesen worden ist, dass eine voroperative Chemotherapie im Vergleich mit der Chemotherapie nach Operation keine Nachteile zeigt, werden vor allem bei großen Tumoren den betroffenen Patientinnen jetzt vermehrt voroperative Chemotherapien angeboten.
Durch eine Chemotherapie vor der Operation (primär systemische Chemotherapie, neoadjuvante Chemotherapie) erfolgt die frühmöglichste Therapie der bösartigen Brusterkrankung nicht nur im Bereich der Brust selber sondern auch im Bereich der Lymphknoten und anderer Körperorgane, wie Lunge, Leber und Knochen.
Untersuchungen in USA und in Europa haben ergeben, dass in ca. 25% der so behandelten Patientinnen ein komplettes Verschwinden des bösartigen Tumors vor der Operation zu sehen ist. In 60% kommt es zu einer deutlichen Verkleinerung des Tumors. Durch dieses sehr gute Ansprechen kann vermehrt brusterhaltend operiert werden, teilweise bis zu 80%.
Der Vorteil einer voroperativen Chemotherapie, meist als Kombinationstherapie mit einem Taxan-Präparat, Anthrazyclin und Cyclophosphamid, ist, dass die Patientin und die behandelnden Ärzte den Erfolg der Therapie selber verfolgen können. Im Fall eines guten Ansprechens tastet die Patientin die Abnahme des Tumors und ist für die Weiterführung dieser Therapie in hohem Maße motiviert.

Genexpressionanalyse in Verbindung mit neoadjuvanter Chemotherapie

An der Frauenklinik des Klinikums Ibbenbüren (Leiter PD. Dr. med. C.M. Schlotter) wird die neoadjuvante Chemotherapie zusammen mit der "Mikroarray-Technologie" (Genexpressionsprofil) den Patientinnen im Rahmen einer kontrollierten Untersuchung angeboten.
Mit der Genexpressionsprofil-Technik können bösartige Tumore jetzt noch genauer charakterisiert werden (Diagnostik), der Verlauf der Erkrankung, wie z.B. Widerauftreten der Erkrankung, können besser beurteilt werden (Prognose), und es können in Zukunft auch bessere Voraussagen über den Erfolg bzw. Ansprechen der medikamentösen Therapie (Chemotherapie, Antihormontherapie) gemacht werden (Prädiktion). Die Gen-Chip Technologie kann den behandelnden Ärzten auch die Information liefern, ob z.B. die wichtigen Östrogen- und/oder Progesteronrezeptoren funktionieren, d.h., ob eine Therapie mit dem Antihormon Tamoxifen auch funktioniert bzw. anspricht.
Der Vorteil des Einsatzes einer Gen-Chip Technologie ist ferner, dass jetzt auch genauer die Stoffwechselwege eines individuellen Tumors erkannt werden können. Dadurch wird es in Zukunft gelingen, neben einer Chemo- und Antihormontherapie noch gezielter so genannte Antikörper und spezielle Stoffwechselhemmstoffe (Tyrosinkinase-Inhibitor) einzusetzen.
Im nachfolgenden Bildmaterial, welches durch bioinformatische Analyse der Mikroarraydaten gewonnen wurden, zeigt sich der hohe zusätzliche Informationsgewinn einer Genexpressionsanalyse. Neben den schon sehr lange als Routinemarker für das Ansprechen einer Antihormontherapie bestimmten Östrogen und Progesteronrezeptor kann nun die Aktivität der den beiden Rezeptoren nach geschalteten Stoffwechselwege mit überprüft werden (über die Aktivität der entsprechenden Gene). Wie in Abbildung 6 und 7 sehr anschaulich zu sehen ist, ergeben sich zwei präzise voneinander zu unterscheidenden Genexpressionssignaturen, die es ermöglichen für die einzelnen Patienten sowohl den Östrogenrezeptorstatus sowie die Aktivität des nachgeschalteten Stoffwechselwegs zu bestimmen. Dies bedeutet nunmehr dass eine viel genauere Vorhersagen über das Ansprechen einer Therapie gemacht werden kann und das Therapieversagen weiter eingeschränkt werden kann. Dies ist in der Therapiepraxis ein nicht zu unterschätzender Gewinn, da ca. 20% der Östrogen- und Progesteronrezeptor positiven Patienten mit einer Antihormontherapie nicht den gewünschten Erfolg der Therapie zeigen. Somit wird es möglich diesen Patientinnen bereits bei der Statusermittlung mittels Genexpressionanalyse eine alternativen Therapieform vorschlagen zu können.
Gensignaturen , die es ermöglichen diese Aussagen zu treffen, werden in Zukunft eine wichtige Rolle im Rahmen einer personalisierten Medizin übernehmen. Die moderne Analytik wird sich an den Herausforderungen die diese Form der personalisierten Medizin generieren wird, messen lassen müssen.

Abbildung 6: Genexpressionsprofil bösartiger Brusttumoren, mit postivem Östrogenrezeptor und nachgeschaltetem aktivem Stoffwechselweg.	Abbildung 7: Genexpressionsprofil bösartiger Brusttumoren, mit negativem Östrogenrezeptor und inaktivem Stoffwechselweg.